趙一寧，陳新延，王麗揚(yáng)，沈小蘭，王彥紅

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3. 江蘇省泰州興化市合陳畜牧獸醫(yī)站，江蘇 興化 225733)

奈瑟菌屬(Neisseria)為革蘭陰性菌，屬于奈瑟菌科，奈瑟菌目。迄今為止，已報(bào)道的奈瑟菌約有30種[1]，雖然已有從其他哺乳動(dòng)物或環(huán)境中分離出該菌的報(bào)道[2]，但該菌常被認(rèn)為僅限于人類。這類微生物大多定植于黏膜表面，通常不會(huì)引起明顯的病理表現(xiàn)，也被認(rèn)為是宿主正常菌群的組成部分[3]。然而隨著部分種屬的進(jìn)化，開(kāi)始出現(xiàn)導(dǎo)致人類疾病的2種典型病原體:淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)[4]。而在動(dòng)物上，奈瑟菌已被確定為犬和貓正常口腔菌群的一部分，并作為繼發(fā)于動(dòng)物咬傷動(dòng)物和人類后傷口的重要病原體[5]。在已經(jīng)報(bào)道的關(guān)于動(dòng)物感染奈瑟菌的病例中，并未見(jiàn)到耳道感染病例，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)患犬耳道分泌物進(jìn)行細(xì)菌分離，得到1株細(xì)菌，經(jīng)鑒定為杜馬奈瑟菌(Neisseriadumasiana)，通過(guò)對(duì)其致病性、藥物敏感性進(jìn)行探究，為臨床診治此類細(xì)菌感染提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病例背景 2019年9月，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院接診了1只8歲的薩摩耶犬，臨床檢查發(fā)現(xiàn)耳道有較多的分泌物，具有惡臭味，癢感明顯，隨后使用無(wú)菌棉簽采集患犬內(nèi)耳道分泌物留備病原檢測(cè)。

1.2 細(xì)菌分離 在超凈工作臺(tái)內(nèi)將無(wú)菌棉簽刮取的患犬耳道分泌物接種于綿羊血平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將分離到的菌株分別純化至綿羊血平板和麥康凱平板。24 h后觀察生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色，用奧林巴斯生物顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3 生化試驗(yàn) 用接種針無(wú)菌挑取純化后的菌落接種于葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、還原硝酸鹽、普通瓊脂等一系列奈瑟菌屬鑒定生化反應(yīng)管中，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。

1.4 16S rDNA鑒定 通過(guò)煮沸裂解法制備分離菌株的DNA模板，按照寶生物工程(大連)有限公司16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法用DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠在凝膠電泳儀進(jìn)行電泳，其余擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)搜索比對(duì)，鑒定分離菌。

1.5 小鼠人工感染試驗(yàn) 將6只6周齡BALB/c小鼠(購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心)隨機(jī)分為2個(gè)組，分別為感染組和對(duì)照組，每組3只。取分離菌株37 ℃搖菌16 h，菌液濃度參照參考文獻(xiàn)[6]調(diào)整為5×109CFU/mL，感染組每只小鼠腹腔注射0.1 mL菌液，而對(duì)照組每只小鼠腹腔注射0.1 mL生理鹽水。兩組置于相同飼養(yǎng)環(huán)境中，每日觀察小鼠狀態(tài)。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏片和判定標(biāo)準(zhǔn)來(lái)自杭州微生物試劑有限公司，先挑取分離菌涂布于血平板上，再貼上藥敏片，37 ℃培養(yǎng)24 h后讀取結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 將患犬的耳道分泌物接種于綿羊血平板37 ℃培養(yǎng)24 h后，長(zhǎng)出邊緣整齊、圓形隆起的不溶血灰白色菌落(圖1)，該分離菌株不能在麥康凱平板上生長(zhǎng)。革蘭染色結(jié)果顯示，分離菌株為陰性雙球菌(圖2)。

圖1 分離菌培養(yǎng)形態(tài)

圖2 分離菌鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.2 生化試驗(yàn) 結(jié)果顯示，該分離菌株可以發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖，不能發(fā)酵蔗糖，能還原硝酸鹽，普通瓊脂反應(yīng)為陰性，經(jīng)驗(yàn)證該分離菌株沒(méi)有運(yùn)動(dòng)能力。此結(jié)果與奈瑟菌生化特性基本一致。

2.3 16S rDNA鑒定 分離菌株DNA模板經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳出現(xiàn)了600 bp左右條帶(圖3)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，并在NCBI網(wǎng)站BLAST中比對(duì)，結(jié)果顯示，與杜馬奈瑟菌KY417830.1具有99.6%的同源性，確定該分離菌株為杜馬奈瑟菌。

圖3 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增

2.4 小鼠人工感染試驗(yàn) 人工感染18 h后，對(duì)照組小鼠未見(jiàn)異常，感染組3只小鼠均死亡。感染組小鼠剖檢變化為肝色淡，脾臟腫大，心肌表面有較多白色炎性滲出，腸腔積液(圖4)。肝臟觸片經(jīng)美蘭染色，顯微鏡觀察可見(jiàn)藍(lán)色雙球菌(圖5)，與分離菌鏡檢結(jié)果一致。

圖4 小鼠人工感染試驗(yàn)剖檢結(jié)果

圖5 攻毒小鼠肝觸片美蘭染色結(jié)果(1 000×)

2.5 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)頭孢曲松鈉、美洛西林、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、慶大霉素、丁胺卡那、諾氟沙星、阿莫西林、多西環(huán)素、多黏菌素B、頭孢哌酮/舒巴坦普生、左氧氟沙星、新霉素、妥布霉素、鏈霉素和卡那霉素共17種抗菌藥敏感，僅對(duì)環(huán)丙沙星表現(xiàn)中介。

3 討論

本試驗(yàn)從患犬的耳道分泌物中分離出1株細(xì)菌，通過(guò)對(duì)菌株的培養(yǎng)形態(tài)、生化特性和16S rDNA基因序列的分析，確認(rèn)分離菌株為奈瑟菌屬中的杜馬奈瑟菌。奈瑟菌屬是造成人類發(fā)病和死亡的重要原因之一[7]，在動(dòng)物上的報(bào)道則較為少見(jiàn)，致病機(jī)制也尚不明確，根據(jù)目前的研究進(jìn)展，雖然大多數(shù)奈瑟菌是無(wú)害的共生菌，但在某些特定的情況下，可能會(huì)發(fā)生由共生菌到病原體的轉(zhuǎn)變，并且在組織器官中占據(jù)、生存和繁殖，導(dǎo)致嚴(yán)重的感染[8]。目前已經(jīng)報(bào)道的病例大多數(shù)都與犬貓口腔中的奈瑟菌具有相關(guān)性，已知的包括寵物犬被其他犬咬傷造成的杜馬奈瑟菌引起的皮膚感染[9]，人被貓咬傷后的創(chuàng)口感染[10]等，在這之中最常見(jiàn)的從動(dòng)物咬傷的傷口中培養(yǎng)出的奈瑟菌包括犬奈瑟菌(Neisseriacanis)、動(dòng)物口腔奈瑟菌(Neisseriaanimaloris)、動(dòng)物咬傷奈瑟菌(Neisseriazoodegmatis)和編織奈瑟菌(Neisseriaweaveri)[2]。杜馬奈瑟菌則為近幾年從犬的唾液中分離鑒定出的新種[11]，除此以外，在異物造成口腔損傷、皮膚黏膜損傷的情況下，該細(xì)菌很可能會(huì)穿透黏膜的自然保護(hù)屏障，從而進(jìn)入到其他組織中造成持續(xù)感染[9]。因此在有創(chuàng)口損傷時(shí)，需要及時(shí)進(jìn)行清創(chuàng)消毒處理，避免動(dòng)物的抓咬舔舐造成重復(fù)感染。本次致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌株經(jīng)腹腔注射人工感染小鼠可致其死亡，同時(shí)造成內(nèi)臟器官腫大，引起炎癥反應(yīng)，雖然目前關(guān)于犬奈瑟菌感染的報(bào)道較少，但其在人和動(dòng)物中表現(xiàn)出的危害性應(yīng)該得到足夠重視同時(shí)加以防范。

本試驗(yàn)中患病薩摩耶犬的耳道感染奈瑟菌的原因尚未可知，推測(cè)可能由于其好動(dòng)的天性導(dǎo)致與其他犬類抓咬所致，治療時(shí)可將患犬發(fā)病耳道內(nèi)毛發(fā)剃除后，采用消毒水進(jìn)行沖洗消毒，隨后根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果選取頭孢曲松鈉肌內(nèi)注射3 d，同時(shí)用頭孢曲松鈉配制藥膏外敷，通過(guò)內(nèi)外兼用達(dá)到治療的目的。