李馨月，王文靜，張宗淑，王 超，張 鐵

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)作為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員之一[1]，是一種無(wú)囊膜、二十面體對(duì)稱的單股環(huán)狀DNA病毒[2]。作為已知體型最小感染鴨的病毒[3]，DuCV主要引起感染鴨的法氏囊淋巴細(xì)胞減少、損傷、壞死，組織細(xì)胞增生等現(xiàn)象[4-5]。DuCV輕則會(huì)導(dǎo)致感染鴨脫毛，重則會(huì)造成精神沉郁、呼吸困難、貧血、消瘦、營(yíng)養(yǎng)不良等，甚至導(dǎo)致產(chǎn)蛋鴨的生產(chǎn)性能降低[6]。DuCV還能夠直接破壞鴨的免疫系統(tǒng)[7]，造成免疫器官受損，體液免疫和細(xì)胞免疫功能顯著降低，同時(shí)引起免疫抑制[8]，增加其與細(xì)菌或其他病毒混合感染和繼發(fā)感染的可能性，使病鴨的死亡率升高。有研究表明，已經(jīng)感染DuCV的鴨更容易患上鴨病毒性肝炎、鴨疫里氏桿菌病、鴨瘟、大腸埃希菌病等病癥[9]。

DuCV最早于2003年被德國(guó)學(xué)者Hattermann等從番鴨的法氏囊組織中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[10]，2006年在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)首次檢測(cè)到DuCV感染[11]，而DuCV全基因序列在我國(guó)大陸地區(qū)的首次成功克隆則是在2008年[12]，隨后山東、福建、浙江、四川、江蘇、廣東等地陸續(xù)有相關(guān)研究，但對(duì)于河北地區(qū)DuCV的研究尚不多見。近年來(lái)，隨著DuCV的廣泛流行，混合感染病例也逐漸增多。

本試驗(yàn)旨在通過(guò)分析2株臨床獲取的DuCV的全基因序列及遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，了解河北省臨床感染的DuCV毒株的基因型及遺傳變異情況，以期為DuCV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和科學(xué)防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 由河北省鴨場(chǎng)送檢的48只以脫毛、生長(zhǎng)遲緩為特征的病死鴨法氏囊，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 DH5α感受態(tài)細(xì)胞和病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pMD20-T Vector，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA 2 000 Marker和SanPro 柱式DNA膠回收試劑盒，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPlus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)，購(gòu)自諾唯贊生物科技(南京)股份有限公司。

1.3 主要儀器 生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，電泳儀(北京市六一儀器廠)，PCR儀(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，全自動(dòng)凝膠成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)，臺(tái)式恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 DNA提取 將處理好的樣品，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取DNA。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中DuCV(登錄號(hào)：KC460534)的全基因序列，應(yīng)用Primer(Version 5.0)軟件分析并設(shè)計(jì)特異性引物DuCV-F/R。參照李金麗[13]設(shè)計(jì)的引物DuCV-Q-(1～4)-F/R，用于DuCV全基因組核苷酸的擴(kuò)增。引物序列見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物

1.4.3 DuCV檢測(cè) 以1.4.1中提取的DNA為模板，用DuCV-F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：12.5 μL Mix，10 μL ddH2O，上、下游引物各0.5 μL，模板1.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增完成后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。

1.4.4 DuCV基因組全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序 選取2株1.4.3中結(jié)果呈陽(yáng)性的DNA為模板，用DuCV-Q-1-F/R、DuCV-Q-2-F/R、DuCV-Q-3-F/R、DuCV-Q-4-F/R共4對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)程序同1.4.3，退火溫度根據(jù)Tm值改變。擴(kuò)增完成后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白篩選，挑取單個(gè)菌落于含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.5 DuCV全基因組序列分析 將測(cè)序結(jié)果運(yùn)用DNASTAR軟件進(jìn)行整理與拼接，獲得2株DuCV全基因組序列。運(yùn)用BLAST、DNAMAN和MEGA 7.0軟件，將獲得的2株DuCV全基因組序列與參考株基因組序列比對(duì)，進(jìn)行同源性比較和基因進(jìn)化樹分析。本試驗(yàn)用于核酸序列分析的參考毒株見表2。

表2 用于基因序列比較的參考毒株

2 結(jié)果

2.1 DuCV檢測(cè) 對(duì)48例病死鴨病料組織DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小與目的片段預(yù)期大小相符(圖1)，DuCV陽(yáng)性率為72.92%(35/48)。

圖1 部分DNA樣品鴨圓環(huán)病毒的PCR檢測(cè)

2.2 分段PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，分段擴(kuò)增的條帶大小與目的片段預(yù)期大小相符(圖2)。本試驗(yàn)成功擴(kuò)增選取的2株DuCV的全基因序列，錄入GenBank，登錄號(hào)分別為MW255979和MW255980。MW255979全基因序列長(zhǎng)為1 995 bp，與已報(bào)道的中國(guó)山東株GU131340和中國(guó)廣西株KC460534長(zhǎng)度一致；MW255980全基因序列長(zhǎng)為1 993 bp，與已報(bào)道的中國(guó)北京株HM162348、中國(guó)山東株MF627688、中國(guó)廣西株MK814578、韓國(guó)株JQ740360和中國(guó)臺(tái)灣株KP229366長(zhǎng)度一致。

圖2 2株鴨圓環(huán)病毒分段PCR擴(kuò)增

2.3 全基因組同源性比較 應(yīng)用DNASTAR軟件中的MegAlign進(jìn)行同源性比較，結(jié)果如圖3所示，2株DuCV基因序列的同源性為97.9%；2株DuCV全基因序列與14株國(guó)內(nèi)外參考株序列同源性為82.9%～98.7%，可細(xì)分為2個(gè)數(shù)值段，一個(gè)為94.3%～98.7%，另一個(gè)為82.9%～83.4%；其中MW255979與中國(guó)廣西株MK814578核苷酸同源性最高，為98.7%，與中國(guó)山東株EU022374和中國(guó)廣西株JX241045核苷酸同源性最低，為83.0%；MW255980與韓國(guó)株JQ740360核苷酸同源性最高，為98.6%，與中國(guó)山東株EU022374核苷酸同源性最低，為82.9%。

圖3 2株鴨圓環(huán)病毒和參考毒株基因核苷酸序列同源性比較

2.4 全基因組遺傳進(jìn)化分析 采用MEGA 7.0軟件對(duì)獲得的2株DuCV全基因序列與14株參考序列繪制遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示，DuCV可以分為2個(gè)基因型，分別是以中國(guó)廣西株MK814578為代表的DuCV-1型和以中國(guó)臺(tái)灣株AY394721為代表的DuCV-2型。其中，DuCV-1型又可以分為2個(gè)亞型，MW255979毒株、MW255980毒株和中國(guó)北京株HM162348、中國(guó)山東株MF627688、中國(guó)廣西株MK814578、中國(guó)廣西株KC460528、韓國(guó)株JQ740360均屬于同一亞型；MW255979株與中國(guó)廣西株MK814578遺傳距離最為接近，MW255980株與韓國(guó)株JQ740360遺傳距離最為接近；MW255979和MW255980均屬于DuCV-1型，與屬于DuCV-2型的中國(guó)臺(tái)灣株AY394721、中國(guó)山東株EU022374、中國(guó)廣西株JX241045和中國(guó)福建株KF726087關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 DuCVs基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

本試驗(yàn)擴(kuò)增得到的2株DuCV全基因組內(nèi)均包括6個(gè)大于200 bp的開放閱讀框(Open reading frames，ORFs)：位于正鏈的ORF V1、V2、V3，及位于負(fù)鏈的ORF C1、C2、C3。MW255979毒株：ORF V1(49～927 bp)、ORF V2(1 370～1 519 bp)、ORF V3(1 661～1 810 bp)、ORF C1(1 932～1 159 bp)、ORF C2(1 741～1 379 bp)和ORF C3(400～164 bp)。MW255980毒株：ORF V1(49～927 bp)、ORF V2(1 368～1 517 bp)、ORF V3(1 659～1 916 bp)、ORF C1 (1 930～1 157 bp)、ORF C2(1 739～1 377 bp)和ORF C3(400～134 bp)。

2株DuCV全基因序列的ORF V1編碼氨基酸長(zhǎng)度為292 aa的Rep蛋白，是與病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白。在具有滾環(huán)復(fù)制特征的保守基序(50TPHLQGF56和91YCAKE95)和可啟動(dòng)滾環(huán)復(fù)制過(guò)程中酶促反應(yīng)的dNTP結(jié)合域(14FTINNP19、167GPPGTGKSR175和206DDFYGW211)編碼區(qū)內(nèi)，2株DuCV均未出現(xiàn)核苷酸插入或缺失。位于圓環(huán)病毒負(fù)義鏈上的ORF C1編碼長(zhǎng)度為257 aa的Cap蛋白，作為病毒的核衣殼蛋白，其具有良好的免疫原性[14]。在2株DuCV基因組ORF V1的5′端和ORF C1的3′端之間均存在莖環(huán)結(jié)構(gòu)，目前被認(rèn)為是DuCV復(fù)制的起點(diǎn)。ORF V1的3′端與ORF C1的5′端之間存在1個(gè)由正向重復(fù)4次的堿基序列(下劃線標(biāo)記)組成的四重串聯(lián)重復(fù)序列(QTR)：CACTTGGCAGGGTATTACACTTGG-GCAGCTCGG，推測(cè)其可能作為啟動(dòng)包裝過(guò)程的信號(hào)。現(xiàn)有研究表明，OTR特異的存在于DuCV基因組中，在調(diào)節(jié)Rep和Cap的表達(dá)中有重要作用[15]。位于ORF V1的互補(bǔ)鏈上的ORF C3編碼長(zhǎng)度為79 aa的蛋白，是目前已知的DuCV唯一具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的病毒蛋白[16]。2株DuCV的ORF C3與屬于DuCV-2型的中國(guó)臺(tái)灣株AY394721、中國(guó)福建株KF726087、中國(guó)山東株EU022374和中國(guó)廣西株JX241045的ORF C3具有顯著差異，與報(bào)道相符合[17]，該研究還表明2個(gè)基因型ORF C3 C端的差異氨基酸序列對(duì)于ORF C3胞核定位與凋亡活性的調(diào)控有重要意義。

由于沒(méi)有普遍適用的體外培養(yǎng)DuCV的方法，且對(duì)其致病機(jī)理仍不明確，尚未有商品化的疫苗出現(xiàn)，并且尚未發(fā)現(xiàn)有效治療藥物。目前對(duì)于DuCV的防治手段主要集中在預(yù)防層面，通過(guò)提高鴨群的飼養(yǎng)管理水平，增強(qiáng)鴨群的免疫能力?，F(xiàn)有關(guān)于河北地區(qū)DuCV毒株的報(bào)道少之又少，對(duì)于DuCV基因組的分析研究主要集中于廣西、山東等地，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)河北地區(qū)臨床送檢病料中選取的2株DuCV基因組進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)獲得的2株DuCV全基因序列與近年來(lái)我國(guó)大陸地區(qū)臨床所獲得的DuCV-1型毒株相比，基因型未發(fā)生明顯突變，為進(jìn)一步研究DuCV基因提供了數(shù)據(jù)支持。要更全面地了解河北地區(qū)DuCV流行的基因型現(xiàn)狀，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣品采集范圍加以驗(yàn)證。