趙正偉，黎玉瓊，高?；郏迻|安，于 洋

(1. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002 ; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸藥研究所，甘肅 蘭州 730000)

奶牛胎衣不下(Retained placenta，RP)是指母牛產(chǎn)犢后12～24 h內(nèi)胎衣不能自然排出，有部分或全部滯留在子宮內(nèi)所引起的奶牛子宮疾病[1]。RP可引起產(chǎn)奶量下降、子宮炎、酮病、空懷期延長(zhǎng)、屢配不中等[2-3]。RP發(fā)病率一般為10%～30%[4]，是引起奶牛產(chǎn)后生產(chǎn)性能和繁殖性能下降的主要因素之一，給奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

多種原因均可導(dǎo)致奶牛胎衣不下，包括營(yíng)養(yǎng)不均衡、應(yīng)激、異常分娩、胎次等[5]。圍產(chǎn)期奶牛血液生化指標(biāo)由于營(yíng)養(yǎng)代謝、生理狀態(tài)、飼養(yǎng)環(huán)境以及疾病等因素發(fā)生變化[6-7]。因此，檢測(cè)奶牛圍產(chǎn)期不同階段血液生化指標(biāo)，探尋有效的預(yù)警指標(biāo)，采取有效防治措施，降低RP的發(fā)病率，對(duì)于有效提高奶牛生產(chǎn)效能具有重要的意義。本試驗(yàn)以寧夏地區(qū)某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)的圍產(chǎn)期奶牛為研究對(duì)象，通過檢測(cè)分析血液生化、微量元素及抗氧化指標(biāo)之間的關(guān)系，探討其在奶牛RP發(fā)生中的變化規(guī)律，為奶牛胎衣不下的早期預(yù)警和有效預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 游離脂肪酸(Non-esterified fatty acid,NEFA)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京北檢·新創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：20190911)；維生素A、維生素E、維生素D3、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、碘(Iodine,I)、硒(Selenium,Se)、磷(Phosphorus,P)、鈣(Calcium,Ca)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所(批號(hào)分別為20191008、20191014、20191022、20194056、20194011、20194006、20196203、20196011、20196103、20196144)；腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司(批號(hào)：191220)。

1.2 主要儀器 半自動(dòng)生化儀(北京松上技術(shù)有限公司，型號(hào)：A6)，酶標(biāo)分析儀(無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司，型號(hào)：華衛(wèi)德朗DR-200BS)，全自動(dòng)生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號(hào)：邁瑞B(yǎng)S-420)，全自動(dòng)生化分析儀(廈門海菲生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：TBA-120FR)，放免儀(西安核儀器廠，型號(hào)：XH6080)。

1.3 試驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)與管理 寧夏某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)，存欄8 000頭，舍飼飼養(yǎng)，自由臥欄，設(shè)有運(yùn)動(dòng)場(chǎng)自由活動(dòng)。按照高、中、低產(chǎn)以及干奶期進(jìn)行分群，每個(gè)圈舍按20%頸夾富余率調(diào)整牛群數(shù)量，并根據(jù)營(yíng)養(yǎng)需要飼喂不同的全混合日糧，每日飼喂3次，自由采食、飲水。前期奶牛胎衣不下年發(fā)生率為17%～22%。集中產(chǎn)犢期，每月450頭母牛產(chǎn)犢。

1.4 動(dòng)物選擇 選擇預(yù)產(chǎn)期產(chǎn)前23～19 d的100頭健康奶牛為研究對(duì)象。診斷標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)后(16±4)h內(nèi)，胎衣不能正常排出，確診為胎衣不下。納入標(biāo)準(zhǔn)：正常干奶，年齡3～8歲，2～6胎次，體況評(píng)分在2.5～3.5，無傳染病史。剔除標(biāo)準(zhǔn)：流產(chǎn)、雙胎、死胎、產(chǎn)后癱瘓、真胃移位、產(chǎn)后發(fā)熱(直腸體溫≥40 ℃)、產(chǎn)后腹瀉患牛以及前期參加過其他臨床試驗(yàn)的奶牛均排除于本試驗(yàn)。分組：胎衣正常排出為對(duì)照組(NRP，n=6)，胎衣不下為試驗(yàn)組(RP，n=6)。

1.5 樣品采集 于2019年6—8月采集奶牛產(chǎn)前23～19、16～12、9～5 d和0 d以及產(chǎn)后7、14 d和21 d的血液樣本。于清晨飼喂前，采用一次性真空抗凝管(EDTA-K2抗凝)于奶牛尾根靜脈采血，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血漿于-80 ℃凍存，備用。

1.6 樣品檢測(cè) 血糖(Glucose,Glu)濃度利用葡萄糖氧化酶法，使用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行測(cè)定；維生素A、維生素E、MDA、SOD、GSH-Px、維生素D3、I、Se、P、Ca含量采用北京華英生物技術(shù)研究所試劑盒，使用比色法利用A6半自動(dòng)生化儀進(jìn)行測(cè)定；NEFA含量采用北京北檢·新創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司試劑盒，使用ACS-ACOD法利用東芝120全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定；TNF-α含量采用北京北方生物技術(shù)研究所有限公司試劑盒，使用放射免疫法利用XH6080放免儀進(jìn)行測(cè)定。全部指標(biāo)均在說明書所要求的范圍內(nèi)，所有操作及結(jié)果計(jì)算均按廠家提供的試劑說明書進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組圍產(chǎn)期不同階段奶牛血液生化指標(biāo)及微量元素含量 如表1所示，與NRP組比較，產(chǎn)前23～19、16～12 d和9～5 d以及產(chǎn)后7 d和14 d時(shí)RP組奶牛血液中I濃度降低，差異顯著(P<0.05)，產(chǎn)前0 d和產(chǎn)后21 d時(shí)RP組奶牛血液中I濃度降低，差異極顯著(P<0.01)；與NRP組比較，產(chǎn)前23～19 d和16～12 d以及產(chǎn)后7、14 d和21 d時(shí)RP組奶牛血液中Se濃度降低，差異顯著(P<0.05)，產(chǎn)前9～5 d和0 d時(shí)RP組奶牛血液中Se濃度降低，差異極顯著(P<0.01)；與NRP組比較，產(chǎn)后21 d時(shí)RP組奶牛血液中NEFA濃度升高，差異顯著(P<0.05)；與NRP組比較，產(chǎn)后21 d時(shí)RP組奶牛血液中維生素A濃度升高，差異顯著(P<0.05)；與NRP組比較，產(chǎn)后21 d時(shí)RP組奶牛血液中維生素D3濃度降低，差異顯著(P<0.05)；與NRP組比較，產(chǎn)后14 d和21 d時(shí)RP組奶牛血液中P濃度升高，差異顯著(P<0.05)；與NRP組比較，產(chǎn)后7 d和14 d時(shí)RP組奶牛血液中Ca濃度升高，差異顯著(P<0.05)。

表1 各組圍產(chǎn)期不同階段血液生化及微量元素?cái)?shù)據(jù)對(duì)比

續(xù)表

2.2 各組圍產(chǎn)期不同階段抗氧化物濃度 由表2可知，與NRP組比較，產(chǎn)前16～12 d時(shí)RP組奶牛血液中MDA濃度降低，差異顯著(P<0.05)；產(chǎn)前9～5 d時(shí)RP組奶牛血液中SOD濃度升高，差異顯著(P<0.05)；產(chǎn)前16～12 d時(shí)RP組奶牛血液中GSH-Px濃度升高，差異顯著(P<0.05)；圍產(chǎn)期各階段NRP組和RP組的TNF-α含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 各組圍產(chǎn)期不同階段抗氧化物數(shù)據(jù)對(duì)比

3 討論

日糧中缺乏維生素A、D時(shí)，可引起奶牛胎衣不下的發(fā)生[8]。蔣傳珠等[9]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛血液中維生素E濃度降低時(shí)，胎衣不下的發(fā)病率會(huì)增加。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NRP組和RP組產(chǎn)前各階段血液中維生素A、D3、E差異均不顯著，也沒有明顯變化規(guī)律，產(chǎn)后RP組維生素A、E逐漸升高，可能是因?yàn)镽P組產(chǎn)奶量下降引起。

Se在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著多種生物學(xué)效應(yīng)，其中最重要的是抗氧化性，抗氧化性是硒生化作用的基礎(chǔ)[10]。Se是GSH-Px的活性中心，GSH-Px能清除體內(nèi)代謝時(shí)產(chǎn)生的自由基離子。自由基通過脂質(zhì)過氧化作用，損傷蛋白質(zhì)、核酸，造成組織細(xì)胞損傷，影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，自由基與人和動(dòng)物的許多疾病有著密切的關(guān)系[11]。Se是I型碘甲腺原氨酸脫碘酶(ID-I)的重要組成元素，主要作用是將甲狀腺分泌的T4轉(zhuǎn)化為T3而提供給外周組織，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)Se缺乏時(shí)，ID-I活性降低[10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，奶牛圍產(chǎn)期產(chǎn)前23～19 d和16～12 d，RP組血Se濃度顯著低于NRP組，產(chǎn)前9～5 d和0 d，RP組血Se濃度極顯著低于NRP組，產(chǎn)后7、14 d和21 d，RP組血Se濃度雖仍顯著低于NRP組，但有升高趨勢(shì)。王海軍等[12]研究發(fā)現(xiàn),干奶期牛日糧中Se含量不足,可增加產(chǎn)后胎衣不下的發(fā)病率。血Se濃度下降可導(dǎo)致胎衣不下發(fā)病率增加[13-14]。可見奶牛血Se濃度的高低與胎衣不下存在關(guān)聯(lián)。Noriko[15]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期子宮及胎盤隨妊娠進(jìn)展對(duì)Se的需要量增加,而孕期一般孕畜對(duì)Se的攝入無明顯改變，從而造成了孕畜的低Se狀態(tài)，孕畜體內(nèi)Se水平逐漸降低，導(dǎo)致疾病發(fā)生。

甲狀腺激素能促進(jìn)腸道對(duì)葡萄糖和半乳糖的吸收，促進(jìn)糖原異生和肝糖原的合成，為動(dòng)物機(jī)體提供能量，甲狀腺激素不足時(shí)可導(dǎo)致動(dòng)物生殖紊亂、異常發(fā)情、不育，雄性動(dòng)物性欲下降，精液品質(zhì)低劣，雌性動(dòng)物受胎率下降、流產(chǎn)、弱胎、胎衣不下等一系列生殖疾病[8]。何生虎等[16]報(bào)道，奶牛圍產(chǎn)期疾病的病因與其體內(nèi)I缺乏有著直接或間接的聯(lián)系。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，奶牛產(chǎn)前23～19、16～12 d和9～5 d，RP組血I濃度顯著低于NRP組，而0 d時(shí)RP組血I濃度極顯著低于NRP組，RP組產(chǎn)前血I濃度持續(xù)降低。韓博等[17]選擇寧夏地區(qū)858頭奶牛進(jìn)行日糧Se、I添加試驗(yàn),結(jié)果顯示，試驗(yàn)組奶牛的流產(chǎn)和 RP 發(fā)病率分別降低 2.5%和7.1%,頭日產(chǎn)奶量增長(zhǎng)7.1%。可見妊娠期母體內(nèi)I水平高低與奶牛繁殖障礙有著重要的關(guān)系。

SOD是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的一部分，對(duì)動(dòng)物的健康狀況起著重要作用[18]。以往的研究已經(jīng)揭示了奶牛圍產(chǎn)期疾病、應(yīng)激與SOD濃度升高具有相關(guān)性[19]。Kankofer[20]的研究表明，胎衣不下的奶牛胎盤組織中SOD濃度增加。產(chǎn)前SOD濃度增高表明抗氧化失衡，可能引起胎衣不下的發(fā)生。產(chǎn)前 SOD濃度升高可能是一個(gè)有用的生物標(biāo)志物，可確定奶牛胎衣不下可能性增高[21]。Patel等[22]認(rèn)為,奶牛胎衣不下的起因產(chǎn)前就已存在，應(yīng)盡早在懷孕期間著手預(yù)防。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)前不同階段RP組血Se、I的濃度持續(xù)性顯著低于NRP組，但RP組GSH-Px、SOD濃度高于NRP組，RP組MDA濃度又低于NRP組，可見RP組奶牛產(chǎn)前體內(nèi)就存在某些因子，長(zhǎng)期影響RP組奶牛體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡。RP組奶牛機(jī)體中某些因子的長(zhǎng)期存在，導(dǎo)致其血GSH-Px、SOD濃度長(zhǎng)期維持在較高水平，致使血MDA濃度降低，在奶牛日糧攝入Se、I不變的情況下，造成RP組奶牛血Se、I濃度的顯著降低。因此，通過檢測(cè)奶牛產(chǎn)前血液中Se、I、GSH-Px、SOD濃度的高低，可以預(yù)警奶牛產(chǎn)后胎衣不下的發(fā)生率。

通過本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期產(chǎn)前23～19、16～12、9～5 d和0 d以及產(chǎn)后7、14 d和21 d時(shí)RP組奶牛血液中Se、I的濃度顯著低于NRP組奶牛，產(chǎn)前16～12 d時(shí)RP組奶牛血液中MDA的濃度顯著低于NRP組奶牛，產(chǎn)前16～12 d時(shí)RP組奶牛血液中GSH-Px的濃度顯著高于NRP組奶牛，產(chǎn)前9～5 d時(shí)RP組奶牛血液中SOD的濃度顯著高于NRP組奶牛。因此，圍產(chǎn)期奶牛血液中I、Se、SOD、MDA、GSH-Px濃度變化可作為奶牛產(chǎn)前預(yù)警指標(biāo)。