高飛，胡澤斌，賈崢，董喆，黃杰

Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良（Fuchs endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD）屬于角膜內(nèi)皮失代償?shù)娘@性遺傳性角膜疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性失明合并青光眼。該病主要致病基因?yàn)閠cf4 基因[1]，該基因位于常染色體 18q21.1，全長413 772 bp，包含 34 個外顯子，tcf4 基因上的 CTG 重復(fù)位于其三號內(nèi)含子中。tcf4 基因在發(fā)育中的角膜內(nèi)皮和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，并與許多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互作用，例如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子 β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞凋亡。該病在亞洲人群的發(fā)病率約為 3.8%[2]，含有 CTG 重復(fù)擴(kuò)增的患者表型更嚴(yán)重，這一擴(kuò)增將使視力顯著減退的風(fēng)險增加 30 倍以上。角膜移植是目前挽救患者視力的唯一方法，與沒有 CTG 重復(fù)擴(kuò)增的 Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良患者相比，含有 CTG 重復(fù)擴(kuò)增的患者是急需角膜移植的主要群體。目前唯一有效確定 CTG 重復(fù)擴(kuò)增患者的方法就是進(jìn)行tcf4基因檢測。國家參考品的研制可對國內(nèi) FECD 檢測試劑盒進(jìn)行方法學(xué)評價以確保其各項(xiàng)性能指標(biāo)可靠、確保臨床檢測結(jié)果可靠，為臨床診斷提供有力證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

核酸提取用試劑盒采用寶生物工程（大連）有限公司的產(chǎn)品；Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良參考品的研制所需的細(xì)胞系包含的基因型別：擴(kuò)增型（CTG 重復(fù) 38～52）、風(fēng)險型（CTG 重復(fù) ＞ 52）及 4 個野生型（正常人的樣本）均購自中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2 個非人源的陰性參考品所需原料為采集非人源病原體感染的細(xì)胞，參考品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所采用的試劑盒購自廈門百歐迅生物科技有限公司、深圳泰樂德醫(yī)療有限公司、北京閱微基因技術(shù)股份有限公司和廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料制備 采集足量的臨床新鮮血液樣本并使用含有枸櫞酸鈉的一次性抗凝采血管進(jìn)行保存，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。在滅菌的環(huán)境中，提取臨床血液樣本的單核淋巴細(xì)胞，加入 EB 病毒轉(zhuǎn)化為永生化細(xì)胞系并培養(yǎng)及凍存。用核酸提取試劑盒分別對各型別的永生化細(xì)胞系進(jìn)行 DNA 提取，熒光定量儀測定 DNA 濃度、紫外分光光度計(jì)測定 DNA 質(zhì)量。其中，陽性參考品包括：擴(kuò)增型、風(fēng)險型，2 個非人源大腸桿菌 DNA 與 4 個野生型共同組成陰性參考品。

1.2.2 原料驗(yàn)證 由中國食品藥品檢定研究院采用熒光定量儀對參考品所包含的陽性及陰性樣本的 DNA 濃度進(jìn)行測定，同時采用紫外分光光度計(jì)測定 DNA 質(zhì)量。并將全部樣本進(jìn)行 PCR-毛細(xì)管電泳分析。

1.2.3 參考品的制備 將 10 個樣本的基因組 DNA 稀釋為 50 ng/μl 后分裝于 0.5 ml 旋蓋凍存管中。每套參考品包含 10 個樣本。其中，陽性樣本包括：2 種擴(kuò)增型樣本（CTG 重復(fù) 38～52）、2 種風(fēng)險型樣本（CTG 重復(fù) ＞ 52）；陰性樣本包括：4 種野生型樣本、2 種非人源大腸桿菌樣本。分裝后的參考品放置于 -80 ℃ 超低溫冰箱保存。

1.2.4 參考品的協(xié)作標(biāo)定驗(yàn)證 選擇 5 家tcf4 檢測試劑盒生產(chǎn)或研究單位對分裝后的參考品進(jìn)行驗(yàn)證。5 家單位的檢測方法包括：熒光 PCR 法、DNA 片段分析法、毛細(xì)管電泳法等。驗(yàn)證的性能指標(biāo)包含：①準(zhǔn)確性：檢測試劑盒檢測范圍內(nèi)的tcf4基因不同型別的 4 份陽性參考品；②特異性：檢測試劑盒檢測范圍內(nèi)的 4 份野生型陰性參考品及試劑盒檢測范圍外的 2 份非人源大腸桿菌樣本；③檢測限：在試劑盒規(guī)定的最低檢測限范圍內(nèi)檢測一套參考品所包含的共 10 份樣本。

1.2.5 參考品的穩(wěn)定性驗(yàn)證 由于參考品的保存溫度為-80℃、運(yùn)輸溫度為 -20℃，因此需要對凍融穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。將 1 套參考品凍融 3 次后，使用廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司提供的tcf4 基因 CTG 重復(fù)快速檢測試劑盒（熒光 PCR 毛細(xì)管電泳法）進(jìn)行凍融穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 原料驗(yàn)證的結(jié)果

將參考品所包含的陽性及陰性 DNA 樣本進(jìn)行 PCR-毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)并采用 GeneMapper 軟件進(jìn)行檢測結(jié)果分析，結(jié)果為：全部陽性樣本及 4 種野生型樣本的堿基序列與樣本 CTG 重復(fù)數(shù)一致。檢測的結(jié)果詳見圖 1、表 1。

表1 參考品基因分析結(jié)果

圖1 參考品毛細(xì)管電泳結(jié)果

2.2 不同單位對參考品的協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

5 家tcf4 檢測試劑盒檢測及科研單位，各自采用自行生產(chǎn)的tcf4 檢測試劑盒對本套參考品進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明參考品的組成成分合格，驗(yàn)證結(jié)果見表 2。

表2 5 家單位本參考品的驗(yàn)證結(jié)果

2.3 參考品的穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

將參考品凍融 3 次后，采用廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司提供的tcf4 基因 CTG 重復(fù)快速檢測試劑盒（熒光 PCR 毛細(xì)管電泳法）進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示反復(fù)凍融對參考品的穩(wěn)定性沒有影響，驗(yàn)證結(jié)果見圖 2。

圖2 3 次凍融穩(wěn)定性結(jié)果

3 討論

國家參考品是體外診斷檢測試劑盒研發(fā)及質(zhì)量控制較為關(guān)鍵的一環(huán)，對產(chǎn)品質(zhì)量、企業(yè)自檢及產(chǎn)品上市后的國家監(jiān)督抽驗(yàn)均是一個重要的工具[3-5]。目前，我國用于基因檢測的診斷試劑盒的研發(fā)缺乏參考品的參照和指導(dǎo)[6]，部分企業(yè)需要花費(fèi)大量精力收集并研制企業(yè)參考品用于驗(yàn)證試劑盒的性能指標(biāo)[7]，但由于企業(yè)在臨床資源、倫理審批等方面不具有優(yōu)勢，因此所研制的企業(yè)參考品在樣本來源及覆蓋度等方面均存在不足。另一方面，體外診斷試劑盒的注冊需要篩選臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，而部分企業(yè)由于時間成本、原料成本等原因存在大樣本量特別是臨床陽性樣本的篩選困難。企業(yè)試劑盒的檢驗(yàn)項(xiàng)目及性能指標(biāo)眾多，部分企業(yè)無法保證穩(wěn)定的臨床樣本來源對每一項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證[8]，因此在部分注冊檢驗(yàn)中出現(xiàn)了企業(yè)臨時尋找臨床樣本以補(bǔ)充參考品的現(xiàn)象。這種臨時樣本缺乏連續(xù)性且驗(yàn)證不充分，大量的使用可能會導(dǎo)致對試劑盒考察水平的不一致。由于上述原因，部分試劑盒的研發(fā)企業(yè)比較關(guān)注《注冊檢驗(yàn)用體外診斷試劑國家標(biāo)準(zhǔn)品和參考品目錄》的更新，當(dāng)出現(xiàn)新的國家參考品時，企業(yè)會考慮加大相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)力度以便充分利用國家參考品全面的樣本型別完成試劑盒的研發(fā)和驗(yàn)證。

目前，臨床tcf4 的基因檢測技術(shù)主要包括多重PCR[9]、毛細(xì)管電泳[10]、BSP-測序、DNA 片段分析等方法，NGS 測序不能準(zhǔn)確地測定該基因的高 CTG 重復(fù)數(shù)變異，第三代測序技術(shù)由于成本等原因，尚未大量應(yīng)用于臨床檢測，然而在tcf4 基因檢測中，無論野生型、擴(kuò)增型、風(fēng)險型，國內(nèi)外都缺乏統(tǒng)一認(rèn)可的參考物質(zhì)。本次研制的tcf4 國家參考品不但包含了國內(nèi)常見的tcf4 突變型別，而且對參考品的驗(yàn)證結(jié)果表明該套參考品盤的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性合格，可為 FECD 相關(guān)的tcf4基因檢測試劑盒（熒光 PCR-毛細(xì)管電泳法）的性能評價及臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量評價提供可靠的參考物質(zhì)。