秦晶，吳敬智，劉馨，馬波

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）指由多種因素引起關(guān)節(jié)軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失而導(dǎo)致的以關(guān)節(jié)疼痛為主要癥狀的退行性疾病，臨床表現(xiàn)有關(guān)節(jié)疼痛及壓痛、關(guān)節(jié)活動受限、關(guān)節(jié)畸形、骨摩擦音、肌肉萎縮等[1]。OA 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，危險(xiǎn)因素有肥胖、性別、年齡、遺傳、既往的關(guān)節(jié)損傷以及代謝和內(nèi)分泌疾病等[2]。

在傳統(tǒng)的治療方法中，早期 OA 采用非手術(shù)治療，如運(yùn)動治療、物理治療及藥物治療等，只能在一定程度上減輕疼痛、延緩病情；終末期 OA 采用全關(guān)節(jié)置換術(shù)治療，可以改善關(guān)節(jié)活動度，但是不能使關(guān)節(jié)恢復(fù)原始功能，并且術(shù)后并發(fā)癥多。

隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的研究表明治療 OA 的關(guān)鍵是阻止軟骨和滑膜組織的免疫炎癥以及軟骨細(xì)胞過度凋亡的進(jìn)程，促使軟骨祖細(xì)胞再生、修復(fù)受損的軟骨[3]。自體軟骨細(xì)胞植入術(shù)（autologous chondrocyte implantation，ACI）[4]和自體骨軟骨移植術(shù)（osteochondral autologous transplantation，OAT）被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨再生的有效療法，但是有一些局限性：ACI 需要全身麻醉或局部麻醉（以收獲軟骨細(xì)胞和移植擴(kuò)增細(xì)胞）進(jìn)行兩次膝關(guān)節(jié)手術(shù)、難以獲得足夠數(shù)量的軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞增殖速度慢等[4]；OAT 受供體發(fā)病率、年齡等限制[5]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）沒有以上局限性，不僅易于獲取培養(yǎng)，而且治療 OA 療效顯著，能緩解疼痛，改善功能，促進(jìn)軟骨恢復(fù)，提高患者生活質(zhì)量。本文綜述了各種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎的臨床前試驗(yàn)和臨床研究進(jìn)展。

1 MSCs 治療 OA 的機(jī)制

MSCs 是具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，主要存在于脂肪、骨髓、臍帶、胎盤、牙髓、肌腱及其他組織中。國際細(xì)胞治療學(xué)會給出 MSCs 的最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)[6]：MSCs在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下呈貼壁生長；MSCs 表達(dá) CD105、CD73和 CD90，不表達(dá) CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a或 CD19、HLA II 表面標(biāo)記；在標(biāo)準(zhǔn)的體外分化條件下，MSCs 可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。

MSCs 治療 OA 的機(jī)制：①旁分泌：研究表明 MSCs參與組織修復(fù)的主要機(jī)制是通過旁分泌活性，產(chǎn)生多種具有各種特性的營養(yǎng)因子，減少組織損傷，增強(qiáng)組織修復(fù)[7]。Platas 等[8]研究發(fā)現(xiàn)脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（AD-MSCs）的條件培養(yǎng)基（CM）可能通過旁分泌作用對抗炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)的 OA 軟骨細(xì)胞的過早衰老，對退行性關(guān)節(jié)發(fā)揮保護(hù)作用。②降低炎癥因子水平和趨化因子的濃度[9]。曹娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）治療后兔血清炎性因子 IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-13 水平較治療前明顯下降，證實(shí)了 UC-MSCs 對 OA 的軟骨及滑膜具有保護(hù)作用，其與抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。③歸巢調(diào)節(jié)：MSCs 會優(yōu)先聚集在組織損傷和炎癥部位。在治療 OA 時(shí)，MSCs 能靶向傳遞到受損的關(guān)節(jié)軟骨，抑制免疫介導(dǎo)的軟骨破壞，并通過軟骨分化和內(nèi)在殘余修復(fù)的旁分泌刺激促進(jìn)軟骨修復(fù)[11]。

近年來，越來越多的學(xué)者認(rèn)為 MSCs 來源的外泌體是OA 的潛在治療方案。細(xì)胞外囊泡（EV）是外泌體、微囊泡、逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒（RHP）和凋亡體的混合群體[12]。外泌體是直徑在 50～150 nm 之間的小脂質(zhì)雙層膜囊泡，它作為細(xì)胞間通訊載體，能夠轉(zhuǎn)移核酸（mRNA 和 miRNA）、蛋白質(zhì)和生物活性脂質(zhì)[13]。Tang 等[14]研究發(fā)現(xiàn) hUC-MSCs衍生的外泌體和 hUC-MSCs 在抑制 OA 炎癥反應(yīng)和延緩OA 進(jìn)展方面有著相似的作用。MSCs 來源的外泌體治療OA 的機(jī)制[15]：①抑制炎癥介質(zhì)對軟骨穩(wěn)態(tài)的不良反應(yīng)：抑制 OA 軟骨細(xì)胞中 TNF-α 誘導(dǎo)的促炎性 NF-κB 信號傳導(dǎo)；②促進(jìn)軟骨再生：促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白聚糖和 II 型膠原蛋白；③減少軟骨細(xì)胞凋亡：上調(diào)了 OA 軟骨細(xì)胞中的 SOX9 和 WNT7A 表達(dá)。通過基因修飾可以提高外泌體治療 OA 的療效，研究表明源自 miR-140-5p、miR-155-5p 或 miR-92a-3p 過表達(dá)人 MSCs 的外泌體可以抑制骨關(guān)節(jié)炎鼠模型中的軟骨細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)軟骨組織再生[16-19]；Li 等[20]研究表明來自人 UC-MSCs 的外泌體通過 miR-100-5p/NOX4 軸抑制人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的活性氧（ROS）產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。

2 干細(xì)胞制劑臨床前安全性評價(jià)

宋征和馬璟[21]建議在進(jìn)行臨床前安全性評價(jià)時(shí)所選擇的動物種屬應(yīng)該能對藥物產(chǎn)生與人體類似的生物學(xué)反應(yīng)，需考慮該種屬動物與人體在生理和解剖學(xué)上的相似性。非人靈長類動物在生理學(xué)上與人類更接近，相比于其他模型提供的數(shù)據(jù)安全性更高，Zhao 等[22]報(bào)道了牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞（GMSC）體內(nèi)輸注對非人靈長類動物短期和長期毒性的數(shù)據(jù)，為后續(xù)臨床試驗(yàn)的研究提供了參考。Chan 等[23]對同種異體 MSCs 進(jìn)行常規(guī)毒性評價(jià)時(shí)發(fā)現(xiàn)靜脈注射 MSCs 是安全的，不會引起治療大鼠的血液學(xué)、生化和組織學(xué)發(fā)生顯著變化。

2.1 生物分布

干細(xì)胞制劑作為新型治療藥物，與常規(guī)藥物代謝不同，需考察其在體內(nèi)的運(yùn)輸、歸巢、擴(kuò)增、分化以及存在于靶器官及非靶器官的持續(xù)能力[21]。目前評價(jià)干細(xì)胞制劑生物分布的方法有：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR[24]、聯(lián)合單光子發(fā)射 CT（SPECT）/CT[25]、磁共振成像（MRI）[25-26]、生物發(fā)光成像（BLI）[27]和基因轉(zhuǎn)導(dǎo) MSCs（編碼綠色熒光蛋白eGFP）[28]等。Kraitchman 等[25]研究發(fā)現(xiàn)與 SPECT/CT 相比，MRI 的敏感性較低，且無創(chuàng)放射性核素成像非常適合動態(tài)跟蹤 MSCs 到靶器官和非靶器官的生物分布和運(yùn)輸。

2.2 致瘤性

致瘤性評價(jià)是指臨床前評價(jià)中藥物引起動物形成（良性和惡性）腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[29]。馮波等[30]認(rèn)為測試干細(xì)胞的端粒酶活性，分析結(jié)構(gòu)特征，可以幫助了解細(xì)胞的遺傳變異規(guī)律，并且通過克隆形成試驗(yàn)和動物成瘤試驗(yàn)，可以評估干細(xì)胞的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。

Chow 等[31]發(fā)現(xiàn)犬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）遞送至免疫缺陷小鼠的側(cè)腹，能觀察到腫瘤生長；而犬 iPSC 衍生的MSC（iMSC）在多次傳代后保留了穩(wěn)定的表型，在免疫缺陷小鼠中沒有形成畸胎瘤，并且在全身注射后也沒有誘導(dǎo)狗的腫瘤形成。Zhao 等[22]證明 GMSC 在用于治療時(shí)不會導(dǎo)致遺傳毒性和癌變。

馮波等[30]對裸鼠成瘤試驗(yàn)、克隆形成試驗(yàn)和端粒酶活性測定結(jié)果進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn) hUC-MSCs 在裸鼠中不致瘤，克隆形成試驗(yàn)結(jié)果為陰性，端粒酶活性測定結(jié)果正常，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

胡宜等[32]認(rèn)為移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）形成腫瘤的能力具有種屬差異性。佟明華等[33]發(fā)現(xiàn)體外長時(shí)間培養(yǎng)大鼠 BM-MSCs 在 15 代以內(nèi)移植入裸鼠體內(nèi)沒有成瘤性，但是體外培養(yǎng)傳代次數(shù)的增多會增加成瘤性的風(fēng)險(xiǎn)。黃英華等[34]通過裸鼠體內(nèi)成瘤性實(shí)驗(yàn)與 p53、Ki67 蛋白免疫組織化學(xué)染色得出結(jié)論：人 BM-MSCs 在體外可以有限傳代，無顯著惡性轉(zhuǎn)化趨勢。

Froelich 等[35]證實(shí)在人脂肪干細(xì)胞（ASCs）的長期培養(yǎng)過程中，經(jīng)過連續(xù)傳代可能發(fā)生染色體畸變。同時(shí)建議在將人 ASCs 用于干細(xì)胞治療之前，必須評估和考慮它們促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化的潛力，甚至在臨床應(yīng)用中應(yīng)避免 ASCs 的體外擴(kuò)增。

2.3 免疫原性

免疫原性在干細(xì)胞制劑的安全性評價(jià)中常常是重要且困難的，雖然 MSCs 的免疫原性較低，但是為了提高安全性還是應(yīng)該做免疫原性評估。Zhao 等[22]通過檢查血清組胺水平發(fā)現(xiàn) GMSC 移植對小獵犬的全身性過敏反應(yīng)和大鼠的被動性過敏反應(yīng)沒有影響，且 GMSC 輸注不會對自身免疫性關(guān)節(jié)炎或紅斑狼瘡的動物模型造成顯著的副作用。Wang 等[36]使用人源化小鼠模型，證實(shí)了 ENO1 是人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AD-MSCs）中潛在的免疫原性分子。同時(shí)，宋征和馬璟[21]研究表明在臨床前試驗(yàn)中采用免疫抑制的小鼠動物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)不能反映干細(xì)胞制劑在體內(nèi)實(shí)際情況，在進(jìn)行免疫原性評價(jià)時(shí)，需要關(guān)注實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床應(yīng)用之間的差異性。

3 MSCs 治療 OA 的臨床前研究

為了探究 MSCs 對 OA 的治療作用，研究人員已經(jīng)對羊[37]、鼠[38]、狗[39]、兔[40]、馬[41]等動物進(jìn)行了大量的臨床前研究。建立 OA 動物模型的方法有前交叉韌帶橫斷術(shù)（ACLT）[37]、內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)（MM）[37]、碘乙酸單鈉（MIA）誘導(dǎo)[38]、丙泊酚誘導(dǎo)[39]、木瓜蛋白酶誘導(dǎo)[42]等。根據(jù)以往的動物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，局部關(guān)節(jié)內(nèi)注射 MSCs[43]、MSC衍生的外泌體[44]、帶有 MSCs 的支架植入物[45]以及帶有載體介質(zhì)的 MSCs 懸液[42]可以有效緩解 OA。近幾年間充質(zhì)干細(xì)胞骨關(guān)節(jié)炎動物模型臨床前試驗(yàn)總結(jié)如表 1 所示。

表1 近幾年間充質(zhì)干細(xì)胞骨關(guān)節(jié)炎動物模型臨床前試驗(yàn)總結(jié)

4 不同來源的 MSCs 治療 OA 的臨床研究

在 clinicaltrail.gov 查閱發(fā)現(xiàn)，AD-MSCs、BM-MSCs 和UC-MSCs 是被用來治療 OA 最多的 MSCs 來源。Kern等[49]對以上三種來源的 MSCs 進(jìn)行了比較，由表 2 可知，三種來源的 MSCs 各有優(yōu)勢，而現(xiàn)有的研究沒有明確表示哪一種來源的 MSCs 最適合用于治療 OA。若想確定最佳來源，則需要更多的臨床研究。

表2 骨髓、臍帶血和脂肪組織中 MSCs 的比較分析

4.1 AD-MSCs

AD-MSCs 具有易于獲取且軟骨再生能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在治療 OA 方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢。AD-MSCs 來源于髕下脂肪墊（IPFP）和皮下脂肪（SC），而髕下脂肪墊衍生 MSCs（IPFP-MSCs）的增殖和分化能力幾乎不受年齡影響[50]，對于老年 OA 患者是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

AD-MSCs 的安全性和有效性在早期的試驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí)，例如在一項(xiàng)概念驗(yàn)證臨床試驗(yàn)中，Jo 等[51]將 1 ×107、5 × 107、1 × 108低中高三種劑量 AD-MSCs 用于治療膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA），結(jié)果表明 1 × 108為有效劑量，改善了患者 KOA 功能和疼痛，并且通過透明狀關(guān)節(jié)軟骨的再生減少軟骨缺損，無不良事件。在大型病例、長期隨訪研究中，AD-MSCs 治療 OA 也取得了較好的結(jié)果，例如 Freitag 等[52]對 329 例KOA 患者接受關(guān)節(jié)內(nèi) AD-MSCs 治療進(jìn)行評估，報(bào)告了臨床和統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的疼痛改善。研究表明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射脂肪來源的自體基質(zhì)血管組分治療 OA 可以有效緩解膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛，改善功能，修復(fù)軟骨缺損[53-55]。近幾年脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療骨關(guān)節(jié)炎總結(jié)如表 3 所示。

表3 近幾年脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療骨關(guān)節(jié)炎總結(jié)

4.2 BM-MSCs

骨髓是第一個(gè)被報(bào)道含有 MSCs 的來源，含有各種生長因子和細(xì)胞因子，具有旁分泌和免疫調(diào)節(jié)作用，在軟骨和骨骼再生領(lǐng)域備受關(guān)注，但是在臨床使用上具有局限性，因?yàn)樗墨@取具有高度侵入性以及分化能力受年齡影響較大[49]。自體 BM-MSCs 更易于獲取，成本低，沒有免疫排斥和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，老年患者建議使用同種異體BM-MSCs。Gupta 等[60]證明關(guān)節(jié)內(nèi)給予 Stempeucel?（成人骨髓來源、培養(yǎng)、混合、同種異體間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞）是安全的，2500 萬個(gè)細(xì)胞的劑量可能是最有效的，VAS、WOMAC 和 ICOAP 評分有所改善。在獲取 BM-MSCs 的過程中需要關(guān)注：進(jìn)行骨髓抽吸術(shù)麻醉劑的選擇、注射器的型號、骨髓穿刺針類型、抗凝劑的選擇；離體后理想的離心速度和時(shí)間等對細(xì)胞產(chǎn)量的影響[61]。近幾年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療骨關(guān)節(jié)炎總結(jié)如表 4 所示。

表4 近幾年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療骨關(guān)節(jié)炎總結(jié)

4.3 UC-MSCs

UC-MSCs 具有易于獲取、侵入性低、增殖速度快、體內(nèi)外免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于臨床治療各種疾病。在以往的研究中，UC-MSCs 治療 OA 通常會聯(lián)合其他方法，例如截骨術(shù)、微骨折或加入透明質(zhì)酸鈉（HA）等。對于 UC-MSCs 的研究也相對比較成熟，在韓國已有含UC-MSCs 的干細(xì)胞藥物產(chǎn)品——Cartitem，它的主要成分是 hUC-MSCs 和透明質(zhì)酸，治療劑量為 500 μl/cm2（細(xì)胞濃度為 0.5 × 107個(gè)細(xì)胞/ml），在臨床應(yīng)用中其療效和安全性也都得到了驗(yàn)證。Park 等[67]將 Cartitem 移植到缺損區(qū)域之后在 12 周的關(guān)節(jié)鏡評估中觀察到軟骨修復(fù)，VAS 和IKDC 評分在 24 周時(shí)有所改善，在長達(dá) 7 年的隨訪中沒有報(bào)道成骨或腫瘤發(fā)生的病例。Song 等[68]用 Cartitem 治療患者KOA，術(shù)后 1 年和 2 年的 VAS、WOMAC 和IKDC 評分顯著改善，病變部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大量的臨床前和臨床試驗(yàn)將 HA 作為 MSCs 的載體，有研究人員認(rèn)為 HA 可能會使 UC-MSCs 停留在關(guān)節(jié)表面[69]，從而提高療效。與微骨折相比，植入 UC-MSCs 聯(lián)合透明質(zhì)酸復(fù)合物是治療老年患者大面積全層軟骨缺損的可行的再生治療選擇[70]。多項(xiàng)研究表明，對于年輕患者，hUC-MSCs 的植入聯(lián)合高脛骨截骨術(shù)（HTO）是內(nèi)側(cè)隔室骨關(guān)節(jié)炎和內(nèi)翻畸形患者的有效治療方法[71-73]。

5 MSCs 治療 OA 的策略改進(jìn)

對于 MSCs 治療 OA，可以通過生物支架、載體、聯(lián)合手術(shù)或基因修飾等方法改進(jìn)。Morille 等[45]研究發(fā)現(xiàn)植入釋放軟骨誘導(dǎo)因子的支架上的 hMSCs 可以原位分化并形成軟骨樣新組織，可以避免重復(fù)注射生物活性因子。Qiao等[74]報(bào)道了關(guān)節(jié)內(nèi)注射人脂肪來源間充質(zhì)祖細(xì)胞（haMPCs）加微骨折和 HA 可以改善患者膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。對于內(nèi)側(cè)隔室骨關(guān)節(jié)炎和內(nèi)翻畸形的年輕患者可以采用高脛骨截骨術(shù)和 MSCs 聯(lián)合治療的方法，可以延緩進(jìn)行全關(guān)節(jié)置換術(shù)的時(shí)間，減輕患者疼痛，改善患者生活質(zhì)量。對MSCs 進(jìn)行基因修飾來提升治療效果的研究大部分還處在臨床前階段，需要更多的試驗(yàn)來證實(shí)長期安全性。

6 發(fā)展與展望

近年來，MSCs 治療 OA 的臨床前和臨床研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。在 MSCs 治療 OA 的臨床試驗(yàn)中，短期安全性已經(jīng)得到驗(yàn)證，但是長期安全性報(bào)道的較少，在未來的工作中還需要進(jìn)行更大樣本長期隨訪試驗(yàn)。同時(shí)，還要解決細(xì)胞移植后的一些問題，例如細(xì)胞存活、細(xì)胞分化差以及與宿主組織整合等。雖然大部分研究顯示 MSCs 治療 OA 可以改善主觀疼痛和功能評分，但很少有研究顯示軟骨信號和MRI 形態(tài)學(xué)改善，因此需要增加對生成軟骨體積測量的研究。對于 MSCs 治療 OA，需要確定注射次數(shù)、最佳治療劑量、最佳來源和佐劑的添加量，在今后的工作中需要有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范和引領(lǐng)這一領(lǐng)域的研究，解決臨床轉(zhuǎn)化的安全性和有效性問題。