蒲明怡 王喆 廖肇忠 鞏遵雙 楊偉燕 華君男 李寧

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071; 2 青島市膠州市婦幼保健計劃生育服務(wù)中心)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是全球常見的人類第二大神經(jīng)退行性疾病，目前仍沒有有效的治愈手段，只能通過藥物延緩其進程[1]。人口老齡化加劇、治療手段缺乏、靶向用藥困難等因素，使得這類老年慢性疾病的治療情況更加嚴峻[2]。因此，深入揭示PD的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點將為PD的治療提供新的策略。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白166(TMEM166),亦稱Eva-1同源蛋白A，最初是2007年在人腎臟cDNA文庫中鑒定出的一個與凋亡和自噬有關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白[3]。對TMEM166-/-和野生型小鼠腦的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有11種蛋白質(zhì)表達上調(diào)，17種蛋白質(zhì)表達下調(diào)，這些蛋白質(zhì)與ATP合成、氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)有關(guān)[4]。并且通過基因富集分析進一步發(fā)現(xiàn)，這些失調(diào)的蛋白與一些神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓病(HD)以及PD等密切相關(guān)[5]，但是TMEM166在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病中的具體作用尚未見研究報道。

線粒體功能障礙引起的神經(jīng)元氧化應(yīng)激在PD的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，MPP+處理的SH-SY5Y細胞是高度模擬神經(jīng)細胞線粒體功能障礙導(dǎo)致氧化應(yīng)激的PD細胞模型[6-7]。本研究嘗試初步探索TMEM166對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞氧化應(yīng)激的影響和機制，以進一步探討自噬與PD的相關(guān)性，為PD的治療提供新的靶點和策略。

1 材料與方法

1.1 細胞和質(zhì)粒

人神經(jīng)母瘤細胞系SH-SY5Y由我院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室提供。Myc-TMEM166過表達質(zhì)粒和Myc空質(zhì)粒由浙江大學(xué)劉偉教授饋贈。

1.2 試劑

CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，活性氧(ROS)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，1-甲基-4-苯基-吡啶碘化物(德國默克公司)，3-甲基腺嘌呤(3-MA)(美國MCE公司)，兔抗人TMEM166多克隆抗體(英國Abcam公司)，兔抗人p62多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人LC3單克隆抗體(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司)，熒光定量PCR試劑盒ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)

將SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.01青霉素/鏈霉素溶液和體積分數(shù)0.10胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2無菌恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期且適宜密度時用于后續(xù)實驗。

1.4 研究方法

1.4.1細胞相對活力檢測 接種SH-SY5Y細胞至96孔板中，待細胞貼壁后，按照高糖DMEM培養(yǎng)基中加入的MPP+濃度不同分為A組(0 mmol/L)、B組(1.0 mmol/L)、C組(1.5 mmol/L)，每組設(shè)5個復(fù)孔，每組細胞培養(yǎng)24、48、72 h時吸出原培養(yǎng)基，每孔分別再加入110 μL含有10 μL CCK8的高糖DMEM培養(yǎng)基，混勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，采用酶標儀測定波長450 nm處的吸光值。

1.4.2細胞中ROS含量檢測 接種SH-SY5Y細胞至6孔板中，待細胞貼壁后，按照A、B組處理方式于高糖DMEM培養(yǎng)基中加入MPP+，培養(yǎng)24 h后吸出原培養(yǎng)基，用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌2次，每孔加入1 mL DCFH-DA(10 μmol)探針，在細胞培養(yǎng)箱孵育30 min后，棄探針，無血清培養(yǎng)基清洗細胞3次，加入1 mL無血清培養(yǎng)基或PBS，熒光顯微鏡下觀察并拍照，實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取均值。

1.4.3蛋白質(zhì)印跡(Western blot)實驗檢測細胞中TMEM166及自噬相關(guān)蛋白質(zhì)的表達水平 取生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞，以每孔2×105個接種于6孔板中。待細胞密度達到80%時，按照A～C組處理方式于高糖DMEM培養(yǎng)基中加入MPP+，培養(yǎng)24 h后，提取總蛋白。配制濃度為12%及5%的SDS-PAGE分離膠以及濃縮膠，等質(zhì)量上樣，先80 V后110 V恒壓電泳，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF膜放入50 g/L BSA的TBST溶液中室溫封閉2 h，取出膜于一抗中孵育，4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，接著室溫下于二抗中孵育1 h，TBST洗膜3次，在避光條件下于ECL顯影液中孵育，上機曝光，并使用Image J軟件分析目的條帶TMEM166、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ和內(nèi)參蛋白β-actin條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值表示相關(guān)蛋白的表達水平。

1.4.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)檢測細胞中TMEM166 mRNA水平 采用TRIZOL法分別提取A～C組SH-SY5Y細胞培養(yǎng)24 h后細胞中總RNA，測定RNA純度與濃度，引物名稱及序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參照，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并進行RT-qPCR。每個樣品分別設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，使用2-△△CT公式計算目的基因的相對表達水平。

表1 引物名稱及其序列

1.4.5細胞轉(zhuǎn)染及3-MA處理 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，以每孔約2×105個細胞的密度接種于6孔板中，待細胞密度達到80%時，使用lipofectamine 2000按照說明書的用量分別轉(zhuǎn)染Myc-TMEM166質(zhì)粒(D組)和Myc載體空質(zhì)粒(E組)，6 h后加入1.0 mmol/L MPP+處理，24 h后裂解細胞提取蛋白，按照1.4.3的方法檢測p62、LC3Ⅱ/Ⅰ和內(nèi)參蛋白β-actin的表達水平。將SH-SY5Y細胞分為D、F 2組，D組按照上述的方法轉(zhuǎn)染Myc-TMEM166質(zhì)粒，6 h后加入1.0 mmol/L 的MPP+處理24 h，F(xiàn)組轉(zhuǎn)染Myc-TMEM166質(zhì)粒，6 h后加入1.0 mmol/L的MPP+和1.0 mmol/L的3-MA共同處理24 h，然后按照1.4.2 的方法檢測細胞中ROS的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組SH-SY5Y細胞的細胞相對活力及ROS含量比較

析因設(shè)計方差分析結(jié)果顯示，時間、組別及交互作用均對細胞相對活力有明顯影響(F組別=32.85，F(xiàn)時間=93.36，F(xiàn)時間*組別=7.60，P<0.05)。單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，B、C組細胞在不同時間的細胞相對活力比較有顯著差異(F=58.56、35.81，P<0.05)，在同一時間點，各組細胞的細胞相對活力比較也有顯著差異(F=21.56～45.16，P<0.05)，見表2。MPP+處理24 h后，A、B組細胞的ROS熒光強度分別為2.548±0.169、8.772±0.379，兩者比較有顯著差異(t=25.94，P<0.05)。

表2 不同時間各組SH-SY5Y細胞相對活力比較

2.2 各組SH-SY5Y細胞中TMEM166蛋白表達水平比較

A～C組SH-SY5Y細胞中TMEM166蛋白的相對表達水平分別為1.004±0.012、0.875±0.035、0.442±0.036，組間比較差異有顯著性(F=290.80，P<0.05)，其中各組間比較差異均具有顯著性(t=5.29～23.02，P<0.05)。A～C組SH-SY5Y細胞中TMEM166 mRNA的表達水平分別為1.005±0.049、2.301±0.108、3.330±0.157，組間比較差異有顯著性(F=315.20，P<0.05)，其中各組間比較差異均有顯著性(t=11.08～25.05，P<0.05)。

2.3 TMEM166過表達對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞的相對活力和ROS含量的影響

D、E組SH-SY5Y細胞TMEM166蛋白表達水平分別為1.944±0.040、0.431±0.017，兩組比較差異有顯著性(t=3.96，P<0.05)；D、E組細胞相對活力分別為0.627±0.023、1.003±0.016，兩組比較差異具有顯著性(t=4.77，P<0.001)；D、E組細胞的ROS熒光強度分別為22.310±1.528、12.320±2.084，兩組比較差異有顯著性(t=6.69，P<0.05)。

2.4 過表達TMEM166對細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平的影響

D組細胞中LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白的表達水平分別為0.772±0.049、0.634±0.071，E組分別為0.137±0.021、1.093±0.033，兩組上述兩種蛋白蛋白表達水平比較差異均具有顯著性(t=2.91、3.99，P<0.05)。

2.5 藥物抑制TMEM166導(dǎo)致的自噬對SH-SY5Y細胞中ROS含量的影響

D、F組細胞ROS熒光強度分別為19.580±1.824、13.280±2.106，兩組比較差異有顯著性(t=3.91，P<0.05)。

3 討 論

PD是第二大神經(jīng)退行性疾病，目前沒有有效治愈方法，其治療耗費巨大，給患者家庭帶來沉重負擔(dān)。近年來對PD的深入研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬與PD的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[5,8]，例如細胞自噬廣泛參與了PD致病蛋白α-突觸核蛋白(α-syn)的降解[9]，SNCA、LRRK2和PINK1/Parkin等家族性PD相關(guān)突變基因的蛋白都參與到了自噬過程中[10-11]。一方面，在家族遺傳性的PD患者群體中，中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中的自噬普遍受到阻滯，不能有效清除細胞內(nèi)的錯誤折疊蛋白而逐漸變性死亡；另一方面，基于這些PD相關(guān)基因(Parkin，PINK1等)構(gòu)建的動物模型中，細胞內(nèi)線粒體質(zhì)量不能得到有效的控制，導(dǎo)致細胞能量平衡破壞，多巴胺能神經(jīng)元之間不能進行高效的細胞信號交流，最終造成PD或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病[12]?；赑D患者神經(jīng)元細胞自噬受阻的這一特點，探索其中的自噬調(diào)節(jié)機制，或許是治療該疾病的關(guān)鍵“鑰匙”。靶向自噬治療PD的理論已被提出并廣泛研究，然而一些新發(fā)現(xiàn)的自噬調(diào)節(jié)蛋白與PD的聯(lián)系還未知，探索這些自噬調(diào)節(jié)蛋白與PD的關(guān)系及其對PD靶向治療的價值具有重要意義。

TMEM166是一種新發(fā)現(xiàn)的促進自噬的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，TMEM166與自噬相關(guān)蛋白16L(ATG16L)存在相互作用，促進ATG12-ATG5/ATG16L復(fù)合物在自噬體膜上的招募，進而促進自噬小泡的形成[13]。TMEM166在腫瘤中的作用也備受關(guān)注，TMEM166在眾多的腫瘤組織中呈明顯的低表達，且其外源性的過表達會減弱腫瘤細胞的“癌性”，表明TMEM166是一種抑癌基因[14-20]。值得注意的是，TMEM166-/-小鼠的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提示，TMEM166極有可能在PD等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮作用[4]。基于此，本研究借助MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y PD細胞模型，初步研究了TMEM166在PD發(fā)生和發(fā)展中的作用。首先，本研究經(jīng)過篩選采用1 mmol/L濃度的MPP+處理神經(jīng)母瘤SH-SY5Y細胞系24 h，產(chǎn)生可辨別的ROS模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)，并且細胞存活數(shù)量較多，適合后續(xù)實驗。其次，本研究發(fā)現(xiàn)，在MPP+處理過程中，TMEM166的mRNA表達水平升高，而其蛋白水平降低，表明TMEM166蛋白在MPP+處理過程中被降解；外源過表達TMEM166再經(jīng)MPP+處理，會促進MPP+誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，表明TMEM166過表達加重了SH-SY5Y細胞的氧化應(yīng)激，不利于細胞存活，這與TMEM166對腫瘤細胞有抑制作用的觀點是一致的[14]，因此細胞會自主地選擇將TMEM166降解。TMEM166在PD細胞模型中被降解以及其降解方式，之前還未見相關(guān)報道，鑒于已有研究的自噬相關(guān)跨膜蛋白LC3及GABARAP都是通過自噬途徑被降解的，而一般的跨膜蛋白是通過溶酶體降解，并且有研究鑒定出TMEM166蛋白存在溶酶體定位[17]，因此推測TMEM166作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，很可能通過自噬途徑被降解，但還需要進一步研究證實。本研究對TMEM166促進氧化應(yīng)激的機制進一步探索發(fā)現(xiàn)，過表達TMEM166會造成自噬銜接蛋白p62的表達水平降低，以及代表噬體膜含量的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平的升高，均提示TMEM166促進了SH-SY5Y細胞的自噬，這與先前發(fā)現(xiàn)TMEM166能夠與ATG16L相互作用促進自噬小泡的形成，并正向調(diào)控自噬功能的研究結(jié)果相一致[13]。對SH-SY5Y細胞過表達TMEM166后，聯(lián)合使用自噬抑制劑3-MA和MPP+處理細胞，結(jié)果顯示藥物抑制自噬可以減少MPP+誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，提示TEMEM166促進的自噬是MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)加重的原因之一。

在自噬參與的各種癌癥中，自噬往往扮演著雙重角色。一方面，自噬的減弱會增加異常功能蛋白質(zhì)的聚集，蛋白質(zhì)質(zhì)量不能得到控制，導(dǎo)致細胞向癌變方向發(fā)展；另一方面，自噬的增強可以為腫瘤細胞的增殖提供能量和原料[21-22]。而在神經(jīng)退行性疾病中，神經(jīng)元中的自噬往往表現(xiàn)出受阻，導(dǎo)致α-syn、tau蛋白或亨廷頓致病蛋白的堆積，而目前已有通過靶向自噬治療神經(jīng)退行性疾病的研究報道[23-25]。

綜上所述，本研究通過MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y PD細胞模型探究TMEM166對神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激的影響和機制，發(fā)現(xiàn)TMEM166促進的自噬對神經(jīng)細胞的生存是不利的，神經(jīng)細胞會降解TMEM166以減弱MPP+的細胞毒性，TMEM166降解障礙可能是促進PD進展的潛在機制之一，這一新發(fā)現(xiàn)可以為PD的自噬靶向治療提供指導(dǎo)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：李寧、王喆、蒲明怡參與了研究設(shè)計；蒲明怡、王喆、廖肇忠、鞏遵雙、楊偉燕、華君男、李寧參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions：The study was designed byLINing,WANGZhe, andPUMingyi.The manuscript was drafted and revised byPUMingyi,WANGZhe,LIAOZhaozhong,GONGZunshuang,YANGWeiyan,HUAJunnan, andLINing.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.