南 洋 董 輝 王志剛 劉樹民

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江哈爾濱 150040

肝臟是由細(xì)胞與非細(xì)胞兩部分組成的，肝纖維化是由多種外界因素刺激肝的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞所導(dǎo)致。致使肝庫普弗細(xì)胞、肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌大量轉(zhuǎn)化生長因子-β，其導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞（hepatocellular stellate cell，HSC）或肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFB）活化，使細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）異常堆積，最終導(dǎo)致肝纖維化[1-2]?；罨腍SC 是肝纖維化發(fā)生的核心。肝臟在受到一定的損傷時(shí)可以進(jìn)行自我修復(fù)，但是多次的損傷會使肝臟的病變不可逆，導(dǎo)致肝纖維化的產(chǎn)生，進(jìn)一步會形成肝硬化甚至發(fā)展為肝癌[3]。各種動物模型被用于這一領(lǐng)域，許多學(xué)者致力于研究標(biāo)準(zhǔn)的肝纖維化模型，幫助肝纖維化的臨床診斷和治療纖維化藥物的選擇與評價(jià)。

1 肝纖維化的機(jī)制

肝纖維化是各種原因造成的慢性肝細(xì)胞反復(fù)損傷所致的肝功能和結(jié)構(gòu)的病理改變，表現(xiàn)為ECM 的大量合成和分解的減少，引發(fā)ECM 成倍沉積，匯管區(qū)大量纖維組織增生異常。病毒侵襲、先天性代謝缺陷、化合物毒性、自身免疫性肝病等因素均可引起肝纖維化。HSC 的激活是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，HSC 主要作用是識別和降解大分子，分泌細(xì)胞因子、生長因子和激素等促進(jìn)細(xì)胞之間的通信及肝臟再生的功能[4]。HSC 為肝的非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞，具有代謝和貯存維生素A 的作用，HSC被激活時(shí)轉(zhuǎn)化為另一種促纖維化的細(xì)胞，即MFB[5]。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h2>

疾病研究的基礎(chǔ)是制備出與人類疾病的發(fā)生機(jī)制、發(fā)展過程相似的實(shí)驗(yàn)動物模型，并且具有可復(fù)制性、操作方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的特點(diǎn)。目前常用的肝纖維化模型造模方法有化學(xué)法、飲食法、手術(shù)和病毒感染。

2.1 化學(xué)方法造模

2.1.1 酒精 酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）通常以肝臟細(xì)胞脂肪堆積開始，逐漸進(jìn)展為肝纖維化和肝硬化。過多的酒精攝入可導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生、谷胱甘肽消耗、脂質(zhì)過氧化和膠原合成增加[6]。這些機(jī)制誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、炎癥和HSC 的活化?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究多采用小鼠急性酒精灌胃法，使肝細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)炎癥，引起肝纖維化病變，并將其控制在肝纖維化階段。但ALD 模型主要涉及輕度肝損傷（即脂肪變性和輕中度炎癥），與人類的嚴(yán)重ALD 存在差別[7]。為了克服這種問題，目前常采用慢性酒精法與急性酒精法結(jié)合應(yīng)用，來模擬人類酒精肝纖維化的環(huán)境，但由于造模方法復(fù)雜、成功率低，應(yīng)用并不廣泛。

2.1.2 四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）CCl4對嚙齒類動物具有廣泛的肝臟毒性，是誘導(dǎo)肝纖維化模型中最常用的方法，在很多方面其與毒性損害有關(guān)的人類慢性疾病相似。細(xì)胞膜上的磷脂分子遭到CCl4的攻擊，形成脂質(zhì)過氧化過程，從而引起小葉中心肝細(xì)胞壞死、庫普弗細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)[8]。通過CCl4和3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫誘導(dǎo)肝細(xì)胞中的微RNA，導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷和再修復(fù)[9]。CCl4作用于HSC，使其激活，轉(zhuǎn)化為MFB，MFB 增殖發(fā)展為肝纖維化，而MFB 在短時(shí)間內(nèi)迅速地成倍堆積，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為肝硬化，更進(jìn)一步會進(jìn)展為肝癌[10]。CCl4方法適用于大鼠和小鼠，采用此法應(yīng)注意特別注射濃度和時(shí)間，因?yàn)镃Cl4毒性極高，容易引起肝硬化、急性毒性死亡。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于價(jià)格低廉、可靠性強(qiáng)和可重復(fù)性較高，是目前應(yīng)用最為廣泛的造模方法。

2.1.3 硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）與CCl4類似，TAA 是一種肝毒性物質(zhì)，經(jīng)細(xì)胞色素P450 活化，產(chǎn)生硫代乙酰胺二氧化硫。其引發(fā)肝毒性的作用機(jī)制尚不明確，可能是其與脂肪酸、氨基酸發(fā)生反應(yīng)，而引起毒性[11]。進(jìn)而造成脂質(zhì)成分過氧化，破壞細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致肝小葉中心死亡，故而誘導(dǎo)HSC 細(xì)胞活化，產(chǎn)生肝纖維化。此方法對大鼠更加敏感，但也可以用于小鼠。最近該大鼠模型已標(biāo)準(zhǔn)化，給藥3 次/周，150 mg/（kg·次），為期8～12 周?？诜o藥建模時(shí)間將更長一些，當(dāng)口服濃度為300 mg/L 時(shí)，C57BL/6小鼠需要2～4 個月才能發(fā)生顯著肝纖維化[12-13]。TAA 模型是常用的肝纖維化模型，主要用于抗纖維化藥物的評價(jià)。

2.1.4 二甲基亞硝胺和二乙基亞硝胺（dimethylnitrosamine/diethylnitrosamine，DMN/DEN）DMN/DEN 均屬N-亞硝基化合物，具有強(qiáng)烈的毒性，主要依靠細(xì)胞色素P450 代謝激活，轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘拇x產(chǎn)物，通過激活DNA 片段、產(chǎn)生活性氧和促進(jìn)金屬蛋白酶活化等多種方式，引發(fā)肝小葉中心壞死，產(chǎn)生肝細(xì)胞癌變[14]。肝組織出現(xiàn)血清總膽紅素顯著升高、肝門脈竇性狹窄、肝門周圍血管擴(kuò)張、肝假小葉形成和炎癥細(xì)胞浸潤等，還有部分可見明顯的膠原纖維增生等現(xiàn)象[15]。Ding 等[16]利用大鼠建立了全面的肝炎-肝纖維化-肝癌模型，為肝病發(fā)展的不同階段模型建立提供了參考。此研究顯示，注射DEN（30 mg/kg）2 次/周，8～12 周病理學(xué)可觀察到肝臟進(jìn)入到肝纖維化階段。或用1%的DMN 溶液（1 ml/kg），腹腔注射1 次/d，3 d/周，連續(xù)4 周[17-18]，也可以形成肝纖維化。

2.2 飲食方法造模

2.2.1 蛋氨酸和膽堿缺乏（methionine and choline deficient，MCD）飼料 目前常用MCD 飼料構(gòu)建研究非酒精性脂肪性肝炎模型。該模型的特點(diǎn)是脂肪酸從脂肪組織流向肝臟和增加甘油三酯，庫普弗細(xì)胞可能在MCD 飼料誘導(dǎo)的肝脂肪變性的起始和進(jìn)展中發(fā)揮作用，因?yàn)槠涫歉渭?xì)胞損傷的第一個應(yīng)答者[19]。巨噬細(xì)胞的浸潤還可以促進(jìn)促炎癥通路和介質(zhì)的上調(diào)，HSC 細(xì)胞被激活將引導(dǎo)病理進(jìn)入纖維化的階段。研究中發(fā)現(xiàn)，NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體激活后，使用NLRP3 選擇性抑制劑可以顯著減緩肝纖維化進(jìn)展[20]。喂食MCD 飼料的小鼠在8 周后出現(xiàn)脂肪性肝炎[21]，而肝纖維化的階段需要更長時(shí)間的喂養(yǎng)才可觀察到[22]。然而這種飲食模式構(gòu)建的動物模型缺乏一些人類患者的主要病理特征，如無血清胰島素、空腹血糖、瘦素和甘油三酯等水平降低。目前常采用復(fù)合造模的方式以改善上述不足，在MCD 飼料的基礎(chǔ)上結(jié)合基因修飾小鼠，能更好地模擬人類肝纖維化特點(diǎn)[23]。

2.2.2 高脂類飼料 非酒精性脂肪性肝炎主要是由于過量食用高脂肪類成分而引起的，患者吸收營養(yǎng)過多而缺乏基本運(yùn)用，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度積累形成肝纖維化。高脂肪飼料克服了MCD 飼料的缺點(diǎn)，因?yàn)閯游矬w重增加和外周胰島素抵抗發(fā)展，該模型通過復(fù)制不良生活習(xí)慣來模擬疾病的病因，具有與人類非酒精性脂肪性肝炎相似的表型特征。但在小鼠中需要52 周才能發(fā)展為僅伴有輕度纖維化的脂肪性肝炎[24]。雄性近交C57BL/6 小鼠是最適合使用高脂肪飲食發(fā)生非酒精性脂肪性肝炎的嚙齒動物，但這種飲食模式的主要缺點(diǎn)是缺乏肥胖和胰島素抵抗。此種造模方式操作簡單，可重復(fù)性強(qiáng)，能表現(xiàn)出與類似于人體內(nèi)肝臟的內(nèi)環(huán)境病變。這種模型適用于高脂類肝纖維化的病理機(jī)制和用藥篩選。

2.3 手術(shù)方法造模

膽總管結(jié)扎可造成膽汁淤積損傷和門靜脈周圍膽道纖維化，其是由兩個結(jié)扎之間橫切的雙結(jié)扎膽管組成[25]。術(shù)后7～10 d，膽管狹窄，膽管壓力升高，膽管上游擴(kuò)張，造成肝體積增大，膽管增生[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，除了HSC 在纖維形成中的相關(guān)作用外，門靜脈纖維化可能是活躍的門靜脈成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的。后者可能通過白細(xì)胞介素-13 激活造血干細(xì)胞形成該模型中的MFB[27]。一般來說，膽總管結(jié)扎后，由于膽漏、膽囊炎或膽囊破裂，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物死亡率高，所以適用于短期研究，難以廣泛推廣。

2.4 遺傳修飾小鼠模型

2.4.1 foz/foz 小鼠 foz/foz 小鼠具有一個突變的Alms1 基因，采用高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)，foz/foz 小鼠會出現(xiàn)脂肪限制，促進(jìn)脂質(zhì)流向肝臟和血清脂聯(lián)素水平下降，膽固醇水平升高，導(dǎo)致脂肪炎癥、肝細(xì)胞損傷，繼而向更嚴(yán)重的纖維化發(fā)展[20]。該模型依賴于飲食和基因修飾的相互作用，從而促進(jìn)肝損傷。因此，實(shí)驗(yàn)表明，喂食高脂飼料時(shí)，這些動物表現(xiàn)出過度肥胖、胰島素抵抗和嚴(yán)重的肝炎，還會伴有明顯的肝纖維化[28]。

2.4.2 db/db、ob/ob 小鼠 db/db 小鼠是瘦素受體點(diǎn)突變導(dǎo)致瘦素信號通路障礙，致小鼠出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗、高血糖、脂肪肝等癥狀。db/db 小鼠高脂肪喂養(yǎng)5 周后，出現(xiàn)明顯的肥胖和脂肪性病變。其白色脂肪組織的特征是氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)增加、巨噬細(xì)胞浸潤、脂聯(lián)素減少和脂質(zhì)代謝受損[29]。db/db 和ob/ob 小鼠的優(yōu)勢是其表型在很多方面都能模擬人類代謝綜合征，缺點(diǎn)在于它們不會自發(fā)形成非酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化。

2.5 基于感染的模型

由于與人類感染的高度相似和高重現(xiàn)性，血吸蟲病是一種具有傳染性的寄生蟲感染疾病，由血吸蟲尾蚴感染宿主，引起肝細(xì)胞的損傷的人與動物共患疾病[30]。蟲卵在肝臟沉積，刺激體內(nèi)的免疫反應(yīng)激活HSC，使HSC 迅速積累，造成炎性肉芽腫，其外圍由MFB 和膠原纖維過度沉積的纖維圍繞，最終形成肝纖維化[31]。孔慶明等[32]運(yùn)用小鼠感染血吸蟲尾蚴建立肝纖維化動物模型，應(yīng)用HE 染色和Masson 染色評估肝臟纖維化，顯示16 周后模型建立成功。但需要注意的是血吸蟲是人與動物均可感染的，所以對實(shí)驗(yàn)室操作要求較高，保證操作研究者的自身安全。

3 小結(jié)與展望

肝纖維化是肝損傷后持續(xù)愈合的結(jié)果，該病的進(jìn)展通常與肝炎病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝病有關(guān)。迄今為止唯一可用的治療方法是肝移植，然而受到治療費(fèi)用高和肝捐贈者數(shù)量有限的阻礙，因此迫切需要找到臨床治療有效的方法。建立可靠穩(wěn)定的動物模型對研究人類肝纖維化有著極大的幫助，能夠幫助研究人員進(jìn)行肝纖維化的機(jī)制和抗纖維化新藥的開發(fā)研究。優(yōu)秀的動物模型應(yīng)該能最大限度地重現(xiàn)疾病發(fā)展的過程，同時(shí)應(yīng)具有良好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。綜上所述，現(xiàn)階段的動物模型可以模擬不同病因所引起肝纖維化，但還不能完全代替人體用來進(jìn)行疾病的發(fā)展和治療研究。隨著不斷深入的研究探索，將會建立出能夠模擬整個病程病機(jī)和藥物篩選的優(yōu)秀動物模型。