王楷宬，姜利建，陳海燕，王素春，莊青葉，5，姜 楠，肖志宇，趙成龍，黃禹豐，李金積，崔成都，孫福亮，徐太輝

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病中心，山東青島 266032；2.青島易邦生物工程有限公司，動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266114；3.延邊大學(xué)，吉林延吉 133003；4.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471023；5.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261061）

Sicinivirus 是一種禽類(lèi)新發(fā)病毒，為單股正向RNA 病毒[1]。在國(guó)際病毒學(xué)分類(lèi)委員會(huì)第十次病毒分類(lèi)報(bào)告（2017 年）中，Sicinivirus 被分類(lèi)為微RNA 病毒科的一個(gè)新屬，目前僅有1 個(gè)“種”（species），即Sicinivirus A。根據(jù)基因序列將其分為5 個(gè)基因型，Sicinivirus A1—A5，縮寫(xiě)為siv-A1—A5。

目前Sicinivirus 的致病性和致病機(jī)理尚不清楚。有研究認(rèn)為其可能是腸道中一種常在病毒，也有研究推測(cè)該病毒可能和其他腸道病毒共感染導(dǎo)致并發(fā)癥，可能與雞的發(fā)育遲緩綜合征（RSS）、腹瀉和吸收不良綜合征（MAS）有關(guān)。肉雞傳染性發(fā)育遲緩綜合征（infectious stunting syndrome，ISS）早在1949 年就有報(bào)道，20 世紀(jì)70 年代后期呈全球性發(fā)生，波及許多國(guó)家和地區(qū)，臨床研究以及人工感染試驗(yàn)均證實(shí)該病具有傳染性[2]。

2014 年，Sicinivirus 在愛(ài)爾蘭首次被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)世界各地都有檢出該病毒的報(bào)道，如愛(ài)爾蘭、中國(guó)、英國(guó)、匈牙利、巴西都檢測(cè)到了該病毒。Bullman等[1]對(duì)愛(ài)爾蘭一家商品雞肉加工場(chǎng)采集的30 份雞泄殖腔樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Sicinivirus 陽(yáng)性率為73%。Zhou 等[3]對(duì)江蘇省鹽城市的商品雞場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的17 份雞糞便樣品均為Sicinivirus 陽(yáng)性，雖然樣品量較少，但如此高的陽(yáng)性率表明該地區(qū)商品雞場(chǎng)中可能存在廣泛的感染。此外，利用高通量測(cè)序技術(shù)，在中國(guó)香港、英國(guó)、匈牙利和巴西的雞中也檢到了該病毒[4-7]。

目前，Sicinivirus 的研究還處于初級(jí)階段，僅部分國(guó)家進(jìn)行了該病毒檢測(cè)，研究數(shù)據(jù)極為有限。該病毒在我國(guó)的流行情況尚不明晰。本研究對(duì)我國(guó)部分地區(qū)進(jìn)行了Sicinivirus 流行病學(xué)調(diào)查，并分析了其感染率與地域、宿主、場(chǎng)戶(hù)類(lèi)型之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年下半年，分別在江蘇、廣西、河北、安徽、廣東、上海、湖北和江西等8 個(gè)省（自治區(qū)、直轄市），隨機(jī)選擇25 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)，采集240 份家禽咽喉/泄殖腔雙拭子樣品，將同一只家禽的泄殖腔拭子和咽喉拭子合并作為1 份樣品保存。共采集1 920 份樣品，其中雞、鴨、鵝、鴿、鷓鴣的咽喉/泄殖腔雙拭子樣品分別為1 221、419、40、235 和5 份。采樣場(chǎng)點(diǎn)涉及15 個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、7 個(gè)批發(fā)市場(chǎng)、1 個(gè)屠宰場(chǎng)和2 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)。

咽喉/泄殖腔雙拭子樣品放置在裝有PBS-甘油采樣液的離心管中，將存有樣品的離心管置于管架并編號(hào)，保持直立狀態(tài)置于放有冰袋的泡沫保溫盒中運(yùn)輸，-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

QIAxtractor 高通量核酸提取儀（cador Pathogen 96 QIA cube HT kit），購(gòu)自德國(guó)Qiagen公 司；PathAmp FluA Reagent Kit、Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 318 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress Batcode Aaptors、Qubit 核酸濃度測(cè)定儀配套試劑，均購(gòu)自L(fǎng)ife technologies 公司。

1.3 引物合成

檢測(cè)引物參考Zhou 等[3]擴(kuò)增Sicinivirus 編碼3D 蛋白保守區(qū)cDNA 所設(shè)計(jì)的1 對(duì)引物S8F 和S8R，用于擴(kuò)增652 bp 的3D基因片段。上游引物：5′-GCTCTATTTCTCGCGTTGCAAT；下游引物：5'-GCCTCCCTTCATGATGTACCAC。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.4 樣品PCR 檢測(cè)和測(cè)序鑒定

取出-80 ℃保存的雙拭子，待解凍后，室溫下10 000 r/min 離心5 min。每個(gè)樣品取200 μL 上清液加入96 孔加樣槽中，使用 QIAxtractor 高通量核酸提取儀及其配套試劑盒提取病毒RNA，將提取的核酸-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用HiScript II One Step RT-PCR Kit 試劑盒，對(duì)提取的病毒RNA 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：50 ℃ 30 min；95 ℃2 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳、純化回收后，由上海生工生物工程公司測(cè)序；利用 DNAstar 軟件中的Seqman 程序?qū)λ鶞y(cè)序列拼接，然后對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，比對(duì)結(jié)果為Sicinivirus 的判為陽(yáng)性樣品。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)PCR 檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果，利用IBM SPSS Statistics 22 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P=0.01 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，分析不同地區(qū)、不同宿主、不同場(chǎng)點(diǎn)的個(gè)體陽(yáng)性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)

PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示：在25 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)中13 個(gè)為陽(yáng)性，1 920 份樣品中，共檢出134 份為Sicinivirus陽(yáng)性，個(gè)體陽(yáng)性率為6.97%（134/1 920），其中河北、湖北、上海、廣東、江蘇、江西、廣西和安徽的個(gè)體陽(yáng)性率分別為24.16%（58/240）、10.83%（26/240）、5.83%（14/240）、5.41%（13/240）、4.16%（10/240）、2.50%（6/240）、1.66%（4/240）和1.25%（3/240），不同地區(qū)個(gè)體陽(yáng)性率差異顯著（df=7，χ2=121.800，P＜0.01）。

2.2 不同宿主

在1 920 份樣品中，共檢出134 份陽(yáng)性樣品，其中132 份的宿主為雞、1 份為鵝、1 份為鴿，鴨和鷓鴣中未檢測(cè)到Sicinivirus，雞、鵝和鴿的個(gè)體陽(yáng)性率分別為10.81%（132/1 221）、2.44%（1/41）和0.42%（1/235），表明雞為Sicinivirus 的主要易感宿主（P＜0.01）。

2.3 不同養(yǎng)殖類(lèi)型

不同養(yǎng)殖類(lèi)型檢測(cè)結(jié)果顯示，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、批發(fā)市場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的個(gè)體陽(yáng)性率分別為3.00%（18/600）、6.23%（58/930）和24.16%（58/240），在150 份養(yǎng)殖場(chǎng)采集的樣品中沒(méi)有檢出Sicinivirus。不同場(chǎng)點(diǎn)類(lèi)型陽(yáng)性率之間的差異任意期望頻率均大于5，采用Pearson 卡方檢驗(yàn)，顯示不同類(lèi)型場(chǎng)點(diǎn)的陽(yáng)性率差異顯著（df=4，χ2=138.169，P＜0.01），屠宰場(chǎng)為最易感場(chǎng)點(diǎn)。

3 討論

本研究首次在我國(guó)開(kāi)展Sicinivirus 流行病學(xué)調(diào)查。本研究采取的方法為配額抽樣的非隨機(jī)抽樣方法，可能會(huì)出現(xiàn)選擇性偏倚和一定的局限。從1 920 份樣品中檢出陽(yáng)性樣品134 份，個(gè)體總陽(yáng)性率為6.97%（134/1 920），場(chǎng)點(diǎn)總陽(yáng)性率為52.00%（13/25），所有被調(diào)查的?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）都檢測(cè)到了Sicinivirus，說(shuō)明該病毒分布較為廣泛。不同地區(qū)陽(yáng)性率差異顯著，河北、湖北的陽(yáng)性率較高，廣東、上海、江蘇其次，而安徽、廣西、江西較低。河北、湖北的所有場(chǎng)點(diǎn)均檢測(cè)到Sicinivirus，是因?yàn)楹颖本鶠橥涝讏?chǎng)采集的雞拭子，湖北均為批發(fā)市場(chǎng)采集的雞拭子和鴨拭子，所以這兩個(gè)地區(qū)的陽(yáng)性率較高可能與宿主、場(chǎng)點(diǎn)類(lèi)型的不同有一定關(guān)系。

從宿主分析結(jié)果來(lái)看，雞的陽(yáng)性樣品數(shù)占總陽(yáng)性樣品的98.50%（132/134），雞群的個(gè)體陽(yáng)性率為10.81%（134/1 221）遠(yuǎn)高于其他宿主，而鵝和鴿的陽(yáng)性率分別為2.44%（1/41）和0.42%（1/235），不同宿主陽(yáng)性率差異顯著。之前的研究還未發(fā)現(xiàn)該病毒可以感染除雞之外的其他宿主。本研究表明，雞依然是最主要的易感宿主，而鵝和鴿也是宿主之一。下一步將對(duì)能夠感染鵝和鴿的病毒株進(jìn)行基因分析。

從場(chǎng)點(diǎn)類(lèi)型來(lái)看，不同類(lèi)型場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性率差異顯著，表明家禽養(yǎng)殖環(huán)境與該病毒的感染有較大關(guān)系。在采集樣品的4 種場(chǎng)點(diǎn)中，屠宰場(chǎng)陽(yáng)性率最高，其次是批發(fā)市場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（統(tǒng)稱(chēng)活禽市場(chǎng)），而養(yǎng)殖場(chǎng)未檢測(cè)到Sicinivirus。活禽市場(chǎng)的禽流動(dòng)性高，且相對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)，衛(wèi)生條件較差，表明病毒在禽間的水平傳播較為嚴(yán)重，間接接觸也可導(dǎo)致病毒傳播。本研究采集樣品的養(yǎng)殖場(chǎng)均為規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，其飼養(yǎng)環(huán)境較好，食物、飲水供應(yīng)以及糞便處理流程規(guī)范，活禽一直處于與外界相對(duì)隔離的狀態(tài)；活禽市場(chǎng)的禽在運(yùn)輸過(guò)程中往往會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致免疫力下降，更易感染病毒，活禽市場(chǎng)以及運(yùn)輸工具消毒不及時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致健康禽受到感染，活禽集中生活在狹小籠子中也會(huì)導(dǎo)致病毒交叉感染；屠宰場(chǎng)陽(yáng)性率最高，與屠宰場(chǎng)衛(wèi)生條件較差、缺乏消毒等防疫管理措施以及環(huán)境污染等因素有關(guān)。本研究未對(duì)散養(yǎng)戶(hù)進(jìn)行調(diào)查，因而散養(yǎng)戶(hù)的Sicinivirus感染情況有待進(jìn)一步研究。

根據(jù)此次流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，建議加強(qiáng)屠宰場(chǎng)和活禽市場(chǎng)的衛(wèi)生管理，對(duì)運(yùn)送活禽的車(chē)輛及時(shí)消毒，減少禽類(lèi)的間接性接觸，屠宰場(chǎng)在進(jìn)行集中屠宰的同時(shí)也要注意不同來(lái)源養(yǎng)殖場(chǎng)禽類(lèi)的相互隔離。這些措施能在一定程度上阻斷病毒的傳播。