陳長福

（龍巖市動物疫病預(yù)防控制中心，福建龍巖 364000）

雞細(xì)小病毒（chicken parvovirus，ChPV）是引起雞腸道疾病的主要病原體之一，主要侵害雛雞，既可水平傳播，也可垂直傳播[1-2]。1984 年，Kisary 等[3]首次鑒定出ChPV；1987 年，伍 荻滕[4]首次證實該病毒存在于國內(nèi)10 日齡雛雞腸道中。該病在美國、匈牙利、波蘭、韓國、加拿大、英國等國家廣泛流行，在美國ChPV 感染率接近80%[5]。圓圈病毒3 型（gyrovirus 3，GyV3）由Chu 等[6]于2012 年首次從兒童糞便中鑒定出來；2018 年李根等[7]首次在患有傳染性腺胃炎的肉雞中鑒定出GyV3。現(xiàn)已證實GyV3 是引起雞傳染性胃腸炎的病原體之一。國內(nèi)除山東省外尚未見其他省（自治區(qū)、直轄市）有關(guān)GyV3 流行的報道。禽白血病（avian leukosis，AL）是禽類多種腫瘤性疾病的總稱，其中J 亞群禽白血病病毒（avian leucosis virus subgroup J，ALV-J）主要引起肉雞的髓細(xì)胞瘤。我國于1999 年從肉雞中分離鑒定出該病毒，隨后國內(nèi)多個省（自治區(qū)、直轄市）有該病發(fā)生的報道。ALV 造成經(jīng)濟損失主要表現(xiàn)在產(chǎn)生腫瘤，導(dǎo)致雞死亡及引起雞的免疫抑制[8-10]。雞傳染性貧血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV）是引起雞傳染性貧血?。╟hicken infectious anemia，CIA）的病原，主要感染2～4 周齡雞群。該病的報道最早可追溯到1959 年。1979 年日本學(xué)者Yuasa 等[11]首次分離鑒定到CIAV（Gifu-1 株）。崔現(xiàn)蘭等[12]1992 年首次在國內(nèi)分離鑒定到CIAV，隨后山東、江蘇、廣東等多地相繼報道了CIAV 的流行[13-16]。

龍巖市是福建省畜牧業(yè)生產(chǎn)大市，2020 年牧業(yè)產(chǎn)值高達(dá)300 多億元，占農(nóng)林牧漁業(yè)總產(chǎn)值的55.5%，肉蛋奶產(chǎn)量68.5 萬t，家禽出欄1.95 億羽，同比增長5.5%，主要家禽產(chǎn)值1.44 億元，同比增長5.2%，家禽業(yè)生產(chǎn)已成為龍巖市農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟中最具活力和最有潛力的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。目前龍巖市尚無ChPV、GyV3、ALV-J 和CIAV 感染的相關(guān)報道。為探明龍巖市規(guī)模化雞場是否存在這4 種病毒的感染，2021 年采集龍巖市各縣（市、區(qū)）雞場病死雞相關(guān)樣品進行PCR 或RT-PCR 檢測，以期為今后龍巖市以及周邊省市規(guī)?；u場主要疫病防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 相關(guān)發(fā)病雞場分布 32 個養(yǎng)雞場病死雞樣品，由7 個縣（市、區(qū)）動物疫病預(yù)防控制中心送檢，其中存欄量1 萬羽以下的主要是家庭農(nóng)場，共有16 個，1 萬～5 萬羽的規(guī)?；u場共9 個，5 萬羽以上規(guī)?；u場共7 個（表1）

表1 不同規(guī)模發(fā)病雞場數(shù)量分布 單位：個

1.1.2 組織樣品來源及處理 2021 年1—11 月龍巖市7 個縣（市、區(qū)）32 個雞場共送檢病死雞肝、脾、腎等組織樣品297 份。組織樣品于生物安全柜內(nèi)剪碎、研磨后，按1:5（m/m）加PBS 制成組織勻漿，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 病毒DNA/RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL 2 000 DNA Marker，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；PCR 擴增相關(guān)酶，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GyV3 SDAU-1 株（GenBank：mg366592.1）VP2基因、ChPV GXCH-PV-25 株（GenBank：MG602515.1）NS1基因設(shè)計特異性引物，參考文獻(xiàn)[17-18]設(shè)計ALV-J 和CIAV 引物，引物序列如表2 所示。所用引物均由福州鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

表2 4 種病毒檢測引物序列

1.2.2 樣品核酸提取及反轉(zhuǎn)錄 參照試劑盒說明書，分別提取組織樣品的總RNA/DNA，并將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-PCR 或PCR 檢測

采用20.0 μL PCR反應(yīng)體系：PCR擴增酶10.0 μL，cDNA 或DNA 模版2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，無菌去離子水7.0 μL?；靹蚝蠓湃隤CR 擴增儀中進行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55～56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。待反應(yīng)結(jié)束后取7.0 μL 反應(yīng)終產(chǎn)物加入至1%瓊脂糖凝膠中，經(jīng)125 V 電泳25 min 后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體情況

對2021 年龍巖市各地采集的297 份病死雞組織樣品進行檢測，結(jié)果4 種病原均有陽性檢出（圖1～2），分別檢出CIAV、GyV3、ChPV、ALV-J 陽性樣品102、85、56、39 份，陽性檢出率分別為34.34%、28.62%、18.86%、13.13%（表3）。從病原分布看，CIAV 分布最廣，除漳平市外其余6 個區(qū)縣均有檢出，各區(qū)縣檢出率介于12.00%～98.00%；其他3 種病原呈局限性分布，均只在4 個區(qū)縣有檢出，各區(qū)縣檢出率也有差異，但均在12.00%以上，其中武平縣GyV3 檢出率高達(dá)92.00%。

表3 龍巖市各縣（市、區(qū)）4 種病毒總體感染情況

2.2 單一感染情況

單一感染統(tǒng)計結(jié)果（表4）顯示：共檢出單一感染陽性樣品79 份，總單一感染陽性檢出率為26.60%（79/297），其中ChPV 的單一感染陽性檢出率最高，單一感染陽性檢出率從高到低依次為ChPV（14.81%）、CIAV（5.05%）、ALV-J（4.71%）、GyV3（2.02%）。

表4 龍巖市各縣（市、區(qū)）4 種病毒單一感染情況

2.3 病毒混合感染

混合感染統(tǒng)計結(jié)果（表5）顯 示：CIAV+ChPV雙重感染陽性檢出率為2.69%（8/297），CIAV+GyV3 為18.18%（54/297）；CIAV+ALV-J+GyV3三重感染陽性檢出率為7.07%（21/297），CIAV+ChPV+ALV-J+GyV3 四重感染為1.34%（4/297）。在混合感染類型中，CIAV 與其他病原的混合感染最普遍，雙重和多重感染均有，在102份CIAV 陽性樣品中，有87 份為混合感染，占85.29%。

表5 龍巖市各縣（市、區(qū)）4 種病毒混合感染情況

3 討論

對龍巖市各地雞場病死雞4 種病毒的感染檢測發(fā)現(xiàn)，2021 年龍巖市存在CIAV、GyV3、ChPV、ALV-J 4 種病原的感染，陽性檢出率為13.13%～34.34%，其中CIAV 分布較廣，陽性檢出率最高（34.34%），其他病原呈現(xiàn)一定的區(qū)域分布特征。ChPV 在漳平市、永定區(qū)、上杭縣和新羅區(qū)有檢測出，檢出率為22.00%～44.12%，與奉彬等[19]報道的廣西地區(qū)肉雞群ChPV 檢出率為16.67%（8/48）相比略高。2018 年，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)成子強團隊首次從患有傳染性腺胃炎的白羽肉雞中分離鑒定出GyV3，并從2014—2018 年采集的336份臨床樣品中檢測出42 份陽性，陽性檢出率為12.50%[20]，而國內(nèi)其他省市暫無GyV3 流行的報道。在本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，GyV3 在龍巖市4 個區(qū)縣有檢出，其中武平縣的檢出率高達(dá)92.00%，其他區(qū)縣檢出率也在20.00%以上，提示GyV3 在龍巖市部分地區(qū)可能廣泛流行。ALV-J 在連城縣、長汀縣、新羅區(qū)和武平縣均有檢出，檢出率分別為42.50%、28.00%、18.00%和12.00%，與國內(nèi)其他地區(qū)的檢測結(jié)果相近，如鮑偉華等[21]對浙江省寧波市雞場進行ALV-J 抗體檢測的陽性率為21.50%，馬亞珍等[10]在新疆3 個縣均檢測出ALV-J 抗體，陽性率為26.00%，邢林林等[22]對山東省7 個種雞場進行ALV-J 抗體檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率為19.80%。這表明龍巖市部分區(qū)縣的ALV-J 流行可能也較為嚴(yán)重，應(yīng)引起重視。李岳等[23]于2016 年1 月—2019 年9月對我國13 個省市規(guī)?；B(yǎng)殖場開展了CIAV 流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)CIAV 感染普遍存在，感染率介于12.50%～25.69%。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CIAV感染率最高，分布也最為廣泛，除漳平市外其余6 個區(qū)縣均有檢出，其中武平縣檢出率高達(dá)98.00%，其他區(qū)縣檢出率也普遍較高（12.00%～50.00%）。研究[14-16]表明，CIAV 與免疫抑制病毒混合感染時，可使CIAV 致病性增強，感染雞群病癥加劇，死亡率增加，這可能是導(dǎo)致CIAV 高陽性率的主要原因之一。

單一感染統(tǒng)計結(jié)果顯示，單一感染陽性檢出率為26.60%（79/297），其中ChPV 單一感染陽性檢出率最高，檢出率從高到低依次為ChPV（14.81%）、CIAV（5.05%）、ALV-J（4.71%）、GyV3（2.02%）。從混合感染統(tǒng)計結(jié)果來看，除漳平市外，龍巖市各區(qū)縣養(yǎng)殖場均存在兩種以上病毒混合感染，混合感染較為普遍，其中最普遍的表現(xiàn)為CIAV 與其他病原的混合感染，如CIAV+ChPV雙重感染陽性檢出率為2.69%（8/297），CIAV+GyV3 為18.18%（54/297）；CIAV+ALVJ+GyV3 三重感染陽性檢出率為7.07%（21/297），CIAV+ChPV+ALV-J+GyV3 四重感染為1.34%（4/297）。在102 份CIAV 陽性樣品中，有87 份為混合感染，占85.29%?；旌细腥臼菙[在當(dāng)今養(yǎng)殖業(yè)面前的一道難題，需要系統(tǒng)研究開展綜合防控。

本調(diào)查的樣品全部來自病死雞，因而檢測結(jié)果并不能代表這些病原的真實流行情況，今后需要系統(tǒng)開展流行病學(xué)調(diào)查，為這4 種疫病的科學(xué)防控提供數(shù)據(jù)支撐。

綜上所述，龍巖市雞群中存在CIAV、ALV-J、ChPV 和GyV3 等4 種病原的感染，且部分地區(qū)感染較為嚴(yán)重，混合感染現(xiàn)象普遍，應(yīng)引起養(yǎng)雞生產(chǎn)者的高度重視，積極開展疫病監(jiān)測，加強雞場的生物安全綜合防控，以保障該地區(qū)家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。