何世成，王紫微，2，丁朝陽，胡巧云，唐小明，王衛(wèi)國，謝怡靈，王昌建

（1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410014；2.衡陽技師學(xué)院，湖南衡陽 421101；3.婁底市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南婁底 417000）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，具有環(huán)狀單股負(fù)鏈DNA 基因組，是較小的動(dòng)物病毒之一[1]，目前已發(fā)現(xiàn)PCV1、PCV2、PCV3 及PCV4 等4 種血清型[2]。

PCV2 基因組全長1 767 或1 768 bp，包含11個(gè)潛在開放閱讀框（ORF），其中ORF1、ORF2為主要的開放閱讀框。ORF1 的主要功能是編碼與復(fù)制酶相關(guān)的Rep 蛋白和Rep'蛋白[3]，ORF2 主要編碼衣殼蛋白（Cap 蛋白），而Cap 蛋白與病毒感染及免疫原性密切相關(guān)。PCV2 根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，可分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d 等8 種基因亞型[4]。1991 年，Clark 等[4]在加拿大西部地區(qū)表現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病豬體內(nèi)分離出一種PCV，發(fā)現(xiàn)其與PCV1 的抗原性和致病性均存在差異，因此將該病毒命名為PCV2。此后，全球多國豬場發(fā)現(xiàn)了PCV2 感染。1995 年，我國臺(tái)灣地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)PCV2 感染[5]。目前我國PCV2感染率較高，流行廣泛，其中PCV2d 為優(yōu)勢流行亞型[6-8]。

本研究通過了解湖南省PCV2 的遺傳變異情況，以期為PCV2 感染的免疫防控、疫苗研究和實(shí)驗(yàn)室診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在湖南省821 份臨床病料和屠宰場豬淋巴結(jié)樣品中，通過檢測獲得30 份PCV2 陽性Ct ≤30的樣品核酸。

1.2 主要試劑和設(shè)備

PCV1 和PCV2 型雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測試劑盒，購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；2×TaqMaster Mix，購自安諾論生物科技有限公司；50×TAE 緩沖液，購自北京索萊寶科技有限公司；Agarose，購自BIOWEST 公司；Super GelRed 核酸凝膠染料10 000×，購自蘇州宇恒生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker 和DNA 凝膠回收試劑盒，購自東盛生物科技有限公司；PCR 擴(kuò)增儀，購自西安天隆科技有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，購自北京六一儀器廠；紫外凝膠成像儀，購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

PCV2 全基因P1 和P2 擴(kuò)增引物對，根據(jù)Gagnon 等[9]設(shè)計(jì)的引物合成（表1）。

表1 PCV2 全基因PCR 擴(kuò)增的引物信息

1.4 全基因組擴(kuò)增及測序

PCV2 擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25.0 μL：無菌無核酸酶水7.5 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板3.0 μL。PCV2 擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s，59 ℃（P1）/56 ℃（P2）退火30 s，72 ℃延伸1 min，共37 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后取5.0 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳35 min，紫外凝膠成像儀中觀察結(jié)果、拍照。陽性條帶切膠回收后編號(hào)，送擎科生物有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.5 遺傳進(jìn)化分析

將同一編號(hào)的4 個(gè)不同測序結(jié)果，通過DNAstar 中SeqMan 軟件進(jìn)行拼接獲得全基因序列，選取國內(nèi)外22 株P(guān)CV2 序列作為參考（表2），利 用NCBI 的BLAST 比對分析。PCV2 全基因及ORF2 的核苷酸序列同源性，利用DNAstar 中MegAlign 軟件進(jìn)行比對；系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹，使用MEGA-X64 生物軟件繪制，通過軟件中Clustal W比對方法進(jìn)行比對；采用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹。

表2 PCV2 參考序列

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組擴(kuò)增

使用P1、P2 引物，對PCV2 陽性樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出亮帶，產(chǎn)物與預(yù)期片段一致，分別為1 045、1 254 bp（圖1）。共獲得15株P(guān)CV2 全基因組（表3）。

表3 PCV2 分離株的來源信息

2.2 遺傳進(jìn)化分析

對本試驗(yàn)中獲得的15 株P(guān)CV2 全基因組與國內(nèi)外上傳至GenBank 中的22 株P(guān)CV2 全基因組序列及ORF2 序列使用MEGA-X64 生物軟件繪制系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。

PCV2 全基因組遺傳進(jìn)化樹（圖2）可看出，所有序列分為了4 個(gè)分支，而本研究獲得的15 株P(guān)CV2 全基因組分布在其中的3 個(gè)分支。其中：PCV2d 分支中的全基因組分布較散；PCV2b 中的PCV2-SY54-2017 全基因組單獨(dú)分列1 個(gè)分支，PCV2-CS139-2018 與外國的Po/PCV2/KNA/K-TB60/2013（MN935183.1）遺傳關(guān)系更近，另2株P(guān)CV2b 全基因組與國內(nèi)分離株更接近；PCV2a中，本研究獲得的2株P(guān)CV2a全基因組在同一分支，并與國外分離株分列2 個(gè)分支。

進(jìn)一步構(gòu)建ORF2 遺傳進(jìn)化樹（圖3）發(fā)現(xiàn)：PCV2 的ORF2 遺傳進(jìn)化樹與PCV2 全基因組遺傳進(jìn)化樹的分支基本相同，僅PCV2-SY54-2017 根據(jù)全基因組進(jìn)化樹分析位于PCV2b 分支，而根據(jù)ORF2 進(jìn)化樹分析位于PCV2d 分支中。最終以O(shè)RF2 進(jìn)化樹分析結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，將其此歸類為PCV2d分支，說明該毒株正在發(fā)生進(jìn)化。根據(jù)ORF2 進(jìn)化樹進(jìn)行分型，本研究獲得的15 株全基因組可以分為10 株P(guān)CV2d、3 株P(guān)CV2b 和2 株P(guān)CV2a。

根據(jù)來源樣品的采集時(shí)間，對本研究獲得的15 株全基因組分析發(fā)現(xiàn)，2017 年分出3 株P(guān)CV2d亞型、1 株P(guān)CV2b 亞型，2018 年分出2 株P(guān)CV2d亞型、2 株P(guān)CV2b 亞型，2019 年分出2 株P(guān)CV2d亞型、1 株P(guān)CV2a 亞型，2020 年分出3 株P(guān)CV2d亞 型，1 株P(guān)CV2a亞型（表4），說 明2017—2020 年湖南省的PCV2 優(yōu)勢基因亞型是PCV2d，并可能繼續(xù)保持下去。

表4 根據(jù)年份統(tǒng)計(jì)的15 株P(guān)CV2 全基因組基因亞型結(jié)果 單位：株

2.3 全基因組同源性分析

對本試驗(yàn)獲得的15 株P(guān)CV2 全基因組序列及國內(nèi)外上傳至GenBank 中的22 株P(guān)CV2 全基因組序列，運(yùn)用DNAstar 軟件中的MegAlign 軟件進(jìn)行同源性分析。

結(jié)果（圖4）顯示：本研究獲得的15 株P(guān)CV2全基因組的核苷酸序列同源性為94.7%～99.9%，與國內(nèi)外的PCV2 全基因組同源性為93.1%～100%。不同基因亞型之間的同源性相差較大，PCV2a 與PCV2c之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，同源性最低。本研究獲得的2株P(guān)CV2a（PCV2-XX332-2020 和PCV2-CS865-2019）全基因組核苷酸大小均1 768 bp，與參考的國內(nèi)外的PCV2a 分離株同源性為96.7%～99.9%。本研究獲得3 株P(guān) C V 2 b 亞型基因組，大小均為1 767 bp，與參考的國內(nèi)外PCV2b 亞型分離株同源性為98.4%～99.9%，其中PCV2-CS139-2018 與Po/PCV2/KNA/K-TB60/2013（MN935183.1）分離株同源性最高，為99.9%。本研究獲得的10 株P(guān)CV2d亞型基因組，大小均為1 767 bp，與參考的國內(nèi)外PCV2d 亞型毒株同源性為96.9%～100%，其中PCV2-LD398-2020 與2011 年河南登封分離的DF-1（JN119255.1）分離株同源性最高，為100%。

2.4 ORF2 氨基酸序列比對

本研究獲得的15 株P(guān)CV2 全基因組中，ORF2編碼的Cap 蛋白由233 或234 個(gè)氨基酸組成。PCV2 ORF2 氨基酸序列比對結(jié)果見圖5。

從圖5 可以看出，PCV2 的4 個(gè)亞型PCV2a、PCV2b、PCV2c 和PCV2d 都在部分位點(diǎn)具有保守的氨基酸。PCV2a 的第77、86～91、151、206 和222 位點(diǎn)的氨基酸與PCV2 其他亞型存在差異，第123、191 和206 位點(diǎn)僅在PCV2a 中存在部分全基因組的位點(diǎn)突變。PCV2b 在第57、89 及210 位點(diǎn)與其他亞型存在差異，在第59 位點(diǎn)存在K 和R 的差異。PCV2d 在第53、68、121、134 和215 位點(diǎn)上與其他亞型具有差異性，而在第169 位點(diǎn)存在不同方向的氨基酸突變，在最末端的234 位多1 個(gè)K。

本研究獲得的2 株P(guān)CV2a 亞型ORF2 氨基酸與參考的PCV2a 分離株相比較為穩(wěn)定，在第8、47、63、130 和133 位點(diǎn)與參考 株KX960947 具有相同的突變。本研究獲得的3 株P(guān)CV2b 亞型的ORF2 氨基酸與其他參考分離株氨基酸序列無明顯差異。本研究獲得的10 株P(guān)CV2d 亞型中，除在第169 位點(diǎn)存在不同的氨基酸突變外，僅PCV2-HH192-2020 在第117 位點(diǎn)存在M →L 的突變；較為特別的是PCV2-SY54-2017，其在ORF2 遺傳進(jìn)化樹分型中屬于PCV2d，但在第63、68、90、190、210 和215 位點(diǎn)存在PCV2b 保守的氨基酸，在第121 和134 位點(diǎn)具有PCV2d 保守的氨基酸。

3 討論

PCV2 可造成嚴(yán)重的臨床癥狀，且陽性率較高，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。PCV2 基因亞型較多[4]，對其進(jìn)行分子學(xué)研究可以為PCV2 疫苗開發(fā)及診斷技術(shù)建立提供依據(jù)。閆春春[10]擴(kuò)增湖北省的部分PCV2 陽性樣品，獲得10 株P(guān)CV2分離株，其中有6 株P(guān)CV2d、4 株為PCV2b。夏德利[11]從2015—2018 年國內(nèi)6 個(gè)省份的病料中，擴(kuò)增了66 株P(guān)CV2 分離株，其中有40 株P(guān)CV2d、17 株P(guān)CV2b 和9 株P(guān)CV2a。李金鳳[12]擴(kuò)增2017—2019 年廣西地區(qū)陽性樣品，共擴(kuò)增到18個(gè)PCV2 全基因組序列和26 個(gè)ORF2 序列，其中包 括25 株P(guān)CV2d、15 株P(guān)CV2b 和4 株P(guān)CV2a。而本試驗(yàn)獲得的15 株P(guān)CV2 分離株中，10 株屬于PCV2d 亞型，3 株屬于PCV2b 亞型，另2 株屬于PCV2a 亞型，并顯示出地理差異。本研究表明，PCV2d 已成為目前湖南省的主要流行基因型，其次為PCV2b，與我國其他省份研究結(jié)論相同。

PCV2 中的衣殼蛋白（Cap）與病毒抗原性和致病性相關(guān)，不同基因型編碼的氨基酸差異性較大[13-14]，因此不同亞型的PCV2 的同源性也具有較大差異。本研究中也顯示出不同亞型的PCV2 核苷酸之間的同源性差異較大。

調(diào)查[8]發(fā)現(xiàn)，目前市場上PCV2 商品化疫苗主要是基因亞型為PCV2a/b 的全病毒滅活疫苗。該疫苗對PCV2a 感染具有一定的交叉保護(hù)作用[15]。目前的研究[16-17]表明，存在對PCV2d 具有一定的交叉保護(hù)作用的疫苗。此外也有研究[18]證明，單獨(dú)使用PCV2b 或PCV2d 的VLPs 時(shí)，針對PCV2b 和PCV2d 的交叉保護(hù)效果不明顯，而在單獨(dú)免疫時(shí)效果較好，但疫苗是否真正對PCV2d 存在交叉保護(hù)還需要更多研究去證實(shí)。目前PCV2d亞型已成為流行株，對其流行的控制就需要更加重視。

PCV2 的Cap 蛋白存在6 個(gè)抗原表位，分別位于第69～83、113～127、156～162、169～183、193～207 和231～233 位[19]。根據(jù)氨基酸序列比對可看出，PCV2 的4 個(gè)亞型PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d 都在部分位點(diǎn)具有保守的氨基酸，不同亞型之間差異較大。其中PCV2d 在C 端的234 位點(diǎn)多1 個(gè)K，這可能會(huì)導(dǎo)致PCV2 衣殼表面構(gòu)象表位的改變，造成免疫失敗[20]。本研究獲得的毒株全基因組在所處亞型之間的差異不大，基因較為穩(wěn)定，存在的部分位點(diǎn)突變在其他參考株中也有出現(xiàn)。

綜上所述，PCV2d 已成為湖南省目前主要的流行基因亞型；PCV2 的4 個(gè)亞型PCV2a、PCV2b、PCV2c 和PCV2d 之間的差異較大，突變較為復(fù)雜；不同亞型之間的氨基酸序列差異較大，但在各亞型中，毒株間的ORF2 氨基酸序列無明顯突變。