孫雷濤 劉立云 張文生

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濱州 256600

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是臨床最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率、高增殖率及局部復(fù)發(fā)侵襲等特點(diǎn)。目前膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療原則為在盡可能保留神經(jīng)功能的基礎(chǔ)上全切腫瘤，術(shù)后輔以放化療等綜合治療[1]。然而由于血腦屏障和血瘤屏障的存在，化療藥物選擇性低、滲透能力弱、入胞效率低及耐藥性等限制了化療效果。外泌體（exosomes）作為新型的藥物攜載體，體積小、易通過血腦屏障，同時還能進(jìn)行膜修飾從而增強(qiáng)細(xì)胞特異性靶向作用。在免疫反應(yīng)、安全性上有很大的優(yōu)勢[2]。本研究運(yùn)用體外修飾的外泌體作為阿霉素的載體，通過靶向修飾攜載化療藥物快速、高效、靶向地輸送至膠質(zhì)瘤細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞親和力，減少非靶部位的聚集，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

U87MG 細(xì)胞系（中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）；轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogene 公司），引物由上海生工設(shè)計合成，阿霉素（美國Sigma 公司），熒光染劑PKH67（美國Invitrogen 公司），電穿孔儀（美國Invitrogen 公司），激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 凱基DMEM 完全培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)，待U87MG 細(xì)胞融合程度達(dá)到85%～90%時進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，收集第6～8 代的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。

1.2.2 具有靶向作用外泌體的表達(dá)載體pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD 的 構(gòu) 建 以LAMP2 cDNA為模板設(shè)計引物：LAMP2 Xhol 上游引物序列：TCTCGAGATGGTGGTGTGCTTCCGCCT，LAMP2 Xhol下游引物序列：AACTAGTAAATTGCTCATATCCAGC。通過PCR 將Flag-iRGD 序列插入LAMP2 cDNA 的3’端，獲得LAMP2-Flag-iRGD 融合基因，通過酶切，將該融合基因克隆至pCDNA3.1 真核表達(dá)載體中，獲得載體pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD。

1.2.3 U87MG 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine 3000）將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入U87MG 膠質(zhì)瘤細(xì)胞（空白轉(zhuǎn)染組：pCDNA3.1/LAMP2；iRGD 靶向轉(zhuǎn)染組：pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD）。將A 液、B 液混勻后懸滴加入六孔板中，標(biāo)記空白轉(zhuǎn)染組、iRGD 靶向轉(zhuǎn)染組，將培養(yǎng)板搖動并輕輕混勻。6 h后更換去外泌體完全培養(yǎng)基。

1.2.4 外泌體的提取 去外泌體完全培養(yǎng)基（超速離心120 000 g，16 h）繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集上清，提取外泌體。反復(fù)超速離心后沉淀即為外泌體和雜質(zhì)蛋白；最后用PBS 將沉淀重懸后繼續(xù)在4℃下100 000 g 離心70 min，最后得到的沉淀即為細(xì)胞外泌體。分別獲得空白轉(zhuǎn)染-外泌體（blank-exo）組和iRGD-外泌體（iRGD-exo）組。

1.2.5 藥物包裝 將純化的外泌體與阿霉素在PBS 中混合，將混合物在37℃搖動溫育1 h，然后添加到冷卻的4 mm 電穿孔比色杯中，用Eppendorf Eporator 在1 kV 下電穿孔混合物20 ms，分別獲得空白轉(zhuǎn)染-外泌體-阿霉素（blank-exo-dox）組、iRGD-外泌體-阿霉素（iRGD-exo-dox）組。

1.2.6 iRGD 的RT-PCR 檢測 取凍存blank-exo組、iRGD-exo 組抽提RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)（iRGD 上游引物序列：5’-TCGATGTTAGACCTGG AAATAGTGGTGCTGTG-3’，iRGD 下游引物序列：5’-CCGGCACAGCACCACTATTTCCAGGTCTAACA-3’，GAPDH 設(shè)為內(nèi)參）。

1.2.7 激光共聚焦觀察細(xì)胞對外泌體的攝取及阿霉素的胞內(nèi)濃度 PK67 分別標(biāo)記blank-exo-dox組和iRGD-exo-dox 組，標(biāo)記的外泌體沉淀用過濾PBS 重懸洗滌，將兩組懸液分別懸滴加入U87MG細(xì)胞培養(yǎng)皿中，共孵育2 h 后，用PBS 液清洗并去除多余外泌體，分別得到blank-exo-dox-U87MG 和iRGD-exo-dox-U87MG。激光共聚焦下觀察細(xì)胞對外泌體的攝取情況及外泌體攜載阿霉素進(jìn)入細(xì)胞的情況。

1.2.8 細(xì)胞增殖檢測 將blank-exo-dox-U87MG和iRGD-exo-dox-U87MG 細(xì)胞分別接種于96 孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)0、24、48、72 h，然后加入10 μl的CCK-8 溶液后繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，在450 nm 處用酶標(biāo)儀測定觀察吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)及單因素方差分析，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 iRGD-外泌體鑒定

通過RT-PCR 觀察iRGD 修飾組mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3.1/LAMP2-Flag-iRGD 后獲取的外泌體中iRGD mRNA 高表達(dá)，而blank-exo 組未見表達(dá)（圖1）。

2.2 iRGD-外泌體-阿霉素靶向U87MG細(xì)胞并增加胞內(nèi)阿霉素濃度

iRGD 能夠與膠質(zhì)瘤細(xì)胞上αν 整合素靶向結(jié)合，共孵育后激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)iRGD-exo-dox 組與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的結(jié)合率為（45.60±9.15）%，顯著高于blank-exo-dox 組的（9.20±3.46）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.428，P=0.003）。說明通過以多肽為標(biāo)靶的iRGD 顯著增強(qiáng)了外泌體對U87MG 細(xì)胞的靶向能力（圖2）。iRGD-exo-dox 組阿霉素主要聚集在U87MG 細(xì)胞核內(nèi)，而在對照組，阿霉素富集低得多，且多位于細(xì)胞周邊（圖3）。

2.3 iRGD-外泌體-阿霉素抑制U87MG細(xì)胞增殖

通過CCK-8 分別檢測blank-exo-dox 組和iRGD-exo-dox 組在24、48、72 h 時細(xì)胞的生長情況。blank-exo-dox 組在450 nm 處OD 值分別為（0.91±0.13）、（0.79±0.11）和（0.67±0.08）。iRGD-exo-dox組 在450 nm 處OD 值 分 別 為（0.55±0.12）、（0.34±0.08）和（0.17±0.06）。iRGD-exo-dox 組抑制率分別為（52.33±8.94）%、（70.15±6.20）% 和（87.16±13.01）%，但blank-exo-dox 組抑制細(xì)胞增殖能力較弱，分別為（18.41±3.69）%、（27.82±5.10）%和（37.31±6.39）%，兩組同一時間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），表明iRGD-exo-dox 高效靶向U87MG 細(xì)胞后通過增加胞內(nèi)阿霉素濃度顯著抑制了細(xì)胞增殖（圖4）。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤術(shù)后化療對延長患者生存的意義重大，但目前總體治療效果仍不甚理想[3-4]。影響化療效果的原因主要為血-腦屏障的存在和腫瘤細(xì)胞的耐藥性及免疫逃逸[5]。膠質(zhì)瘤中存在的腫瘤干細(xì)胞有多種分化能力，有良好的免疫逃逸機(jī)制，耐藥機(jī)制較為復(fù)雜。目前，傳統(tǒng)化療藥物特異性差、耐藥率高、人體毒性作用強(qiáng)，越來越多的研究集中于藥物的靶向性及耐藥機(jī)制的研究[6]。因此尋找小分子量、高穿透性藥物載體來提高局部藥物濃度及靶向作用，成為目前研究的熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)細(xì)胞靶向載體存在運(yùn)載效率低，具有免疫原性易被清除，缺乏靶向性等問題，難以實(shí)現(xiàn)對藥物攜載的穩(wěn)定性和特異性。外泌體作為30～100 nm的脂質(zhì)雙分子囊泡，攜帶蛋白及核酸物質(zhì)，在免疫反應(yīng)、安全性上有很大優(yōu)勢：體積小，易通過血腦屏障；作為一種膜結(jié)構(gòu)載體，通過膜融合方式直接送入靶細(xì)胞中，投遞效率更高。不僅在體內(nèi)、體外均可以加載基因和藥物，同時還能進(jìn)行細(xì)胞膜的修飾從而增強(qiáng)細(xì)胞抗原特異性的靶向作用。外泌體有望成為化療藥物的“金載體”[7]。

國外有研究發(fā)現(xiàn)外泌體通過攜載β 分泌酶siRNA 后外泌體的血腦屏障穿透率明顯提高，而且腫瘤周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞甚至神經(jīng)元中BACE1 的表達(dá)均顯著抑制[8]。近年來，關(guān)于外泌體中內(nèi)容物表達(dá)的研究進(jìn)一步揭示了腦膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，為腦膠質(zhì)瘤的化療耐藥機(jī)制研究、免疫治療、靶向治療等開闊了思路[9]。有研究在斑馬魚膠質(zhì)瘤模型中發(fā)現(xiàn)，大腦內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體作為載體可以攜帶抗腫瘤藥物穿過血腦屏障，治療多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤包括膠質(zhì)瘤[10]。有研究在膠質(zhì)瘤中，證明了組建的工程外泌體能夠順利通過血腦屏障，不僅具備良好的靶向治療效果，毒副作用明顯降低[11]。

研究已證實(shí)整合素ανβ3 在膠質(zhì)瘤的血管生成過程中表達(dá)增加，而且在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株細(xì)胞膜上也高表達(dá)[12]。有研究應(yīng)用RGD 序列多肽作為PET-CT 檢查的顯像劑來觀察不同腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特性，結(jié)果顯示：膠質(zhì)瘤對RGD 的攝取率>肝癌、胰腺癌>腸癌、子宮頸癌[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，iRGD 能特異識別腫瘤細(xì)胞和腫瘤內(nèi)新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表面高表達(dá)的整合素ανβ3 分子[14]。理論上iRGD-外泌體-阿霉素藥物載體就可以攜帶阿霉素快速、高效、靶向地輸送至膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)和瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少其非靶部位的聚集。

雖然阿霉素作為常用的抗腫瘤藥物，在多種惡性腫瘤的治療中應(yīng)用，但由于其劑量毒性及血腦屏障的限制，在中樞神經(jīng)腫瘤的應(yīng)用較少[15]。目前有研究者提出了外泌體作為化療藥物（紫杉醇和阿霉素）和中藥姜黃素的運(yùn)載工具，提高藥物治療效果[16]。充分設(shè)計和利用人自身納米級的藥物載體，不僅具有良好的免疫原性，同時具備良好的靶向轉(zhuǎn)載藥物能力，表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景[17]。在本研究中通過轉(zhuǎn)染iRGD 的外泌體包裹阿霉素成功構(gòu)建了藥物載體，作用于U87MG 細(xì)胞后表現(xiàn)出良好的靶向性，并且能夠顯著抑制U87MG 細(xì)胞的增殖。

目前大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，外泌體同時參與了細(xì)胞間的通訊、免疫應(yīng)答、免疫豁免等細(xì)胞功能，因此，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展各個病理階段均有參與[18]。近年來外泌體作為基因表達(dá)調(diào)控、免疫穩(wěn)態(tài)維持、細(xì)胞通信等方面的研究熱點(diǎn)，取得了一定的進(jìn)展，但中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中外泌體的研究仍處于起步階段[18-19]。目前研究認(rèn)為建立特殊的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、大通量基因組學(xué)及蛋白組學(xué)中探尋特異性液體活檢靶向分子、開發(fā)新的外泌體-抗腫瘤藥物載體是未來中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤外泌體研究的方向和重點(diǎn)[20]。