李 濱 趙健烽 馮麗萍 黃建民 馬德蓉

（1江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)工程學(xué)院 江蘇連云港 222000 2江蘇江山聚源生物技術(shù)有限公司 江蘇泰州 214500）

膠原蛋白是利用酸、酶等提取介質(zhì)從動(dòng)物組織中提取的大分子蛋白質(zhì)，因其具有無毒、易降解、易吸收、低抗原性等特性，深受生物醫(yī)學(xué)及日用化學(xué)領(lǐng)域青睞，被廣泛用作手術(shù)縫合線、止血海綿、人工皮膚、人工血管、人角膜、藥物載體等[1]。但動(dòng)物來源的大分子膠原蛋白仍存在一些問題[2]：1）存在潛在的傳染病危險(xiǎn)，包括動(dòng)物源及人源性傳染?。ɡ纾滩〉龋?；2）存在引起機(jī)體排斥反應(yīng)炎癥的風(fēng)險(xiǎn)；3）排斥反應(yīng)導(dǎo)致的高吸收率使治療頻次增加，成本增加。此外，動(dòng)物源膠原蛋白的提取過程還存在高成本、重污染、獲取率低等缺陷，因此，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組膠原蛋白（recombinant human collagen，RHC）受到廣泛關(guān)注[3]。

重組膠原蛋白的生產(chǎn)工藝為：將來自人體膠原蛋白的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后進(jìn)行酶切，再通過特定序列的整理縫合、與特定表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli）或畢赤酵母（Pichia pastoris）中[1-2]，獲得相對較高的表達(dá)量；通過發(fā)酵、分離、純化手段生產(chǎn)生物重組膠原蛋白[3-8]。因其具有良好的生物學(xué)相容性、細(xì)胞黏附性、促進(jìn)新細(xì)胞形成和止血功能[3]，對重組膠原蛋白在創(chuàng)傷修護(hù)類化妝品中的作用機(jī)理研究，有助于將此類蛋白質(zhì)推廣至日用化妝品領(lǐng)域乃至生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、氯化鈉（分析純）、氯化鉀（分析純）、EDTA（≥99.5%）、DMSO（≥99.9%）、Weigert鐵蘇木素染色液、天狼星紅染色液、MTT試劑盒（碧云天生物）、細(xì)胞黏附檢測試劑盒（上?？道噬铮⒊衫w維細(xì)胞（原代培養(yǎng)）、表皮細(xì)胞（原代培養(yǎng)）、重組膠原蛋白、市售膠原蛋白樣品1（簡稱“市售1”）、市售膠原蛋白樣品2（簡稱“市售2”）、動(dòng)物膠原蛋白、RGD肽（Arg-Gly-Asp多肽，一種已被報(bào)道的細(xì)胞粘附序列，可明顯增加細(xì)胞黏附性）。

儀器：96孔板（Nunc-96，賽默飛世爾，中國）、Franz擴(kuò)散池（Permergear，世聯(lián)博研，美國）、酶標(biāo)儀（MR-96A，貝登醫(yī)療，南京）、低速冷凍離心機(jī)（RC3B PLUS，SORVALL，美國）、光學(xué)顯微鏡（DM3000 LED，徠卡，德國）、石蠟包埋機(jī)（EG1150H，徠卡，德國）、切片機(jī)（KD-3368AM，世紀(jì)科信，北京）、移液器（F1 Clip Tip，賽默飛世爾，中國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 促細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn) 將活性好的細(xì)胞制作成單細(xì)胞懸浮液并統(tǒng)計(jì)數(shù)量，使細(xì)胞密度為104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔中加入細(xì)胞懸浮液200 μL，生長至細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的待測樣品（0.0001%、0.0005%、0.0025%、0.0125%、0.0625%、0.3125%，注：如果有效，可繼續(xù)下調(diào)濃度），每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)重復(fù)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h（每72 h更換一次含膠原蛋白樣品的培養(yǎng)液）。

至每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，向?qū)?yīng)的孔中加入20 μL MTT溶液（用pH=7.4的PBS配制），再培養(yǎng)4 h，停止。

快速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，棄去上清液，每孔添加150 μL DMSO，振蕩10 min溶解MTT結(jié)晶。

用酶聯(lián)檢測儀檢測各孔在490 nm處的吸光值（OD490值），同時(shí)設(shè)置無細(xì)胞孔作為對照組進(jìn)行調(diào)零，取6孔平均值。

以培養(yǎng)時(shí)間與吸光值為坐標(biāo)軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

1）細(xì)胞鋪板：以記號(hào)筆均勻地分割6孔板，中間間隔0.5～1 cm，每個(gè)孔至少橫穿3條線。每孔中大約加入5×105個(gè)/mL細(xì)胞，過夜后可將孔鋪滿。

2）劃痕實(shí)驗(yàn)：第2天使用移液器吸頭垂直于橫線進(jìn)行劃痕，用PBS清洗細(xì)胞3次，洗脫被劃下的細(xì)胞，加入至含有RHC的無血清培養(yǎng)基中，作為對照組；加入至含有實(shí)驗(yàn)樣品（市售1和市售2）的培養(yǎng)基中，作為實(shí)驗(yàn)組，最終濃度為0.05%。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取樣時(shí)間分別為0 h、6 h、24 h。

3）數(shù)據(jù)處理：計(jì)算不同時(shí)間段之間細(xì)胞整體遷移的距離，得出平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差，建立直角坐標(biāo)系，以時(shí)間為橫軸，遷移距離為縱軸作圖，計(jì)算公式如下：

式中：Si表示每個(gè)時(shí)間長度細(xì)胞整體遷移的距離；S0表示0時(shí)距離長度；St表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的距離長度。

1.2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

1）包被：將100 μL包被液加入96孔板，2～8℃條件下過夜。移除包被液，用洗滌液洗滌2～3次。

2）細(xì)胞接種：胰酶消化處理的待測細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，用相應(yīng)培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，按5×104個(gè)/mL細(xì)胞，接種于96孔板；同時(shí)加入含膠原蛋白樣品，RHC終濃度為0.05%和0.01%，設(shè)置5個(gè)重復(fù)。設(shè)立對照組，即未加樣品的細(xì)胞懸液組；設(shè)置含有RGD肽的陽性對照組。放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。取出培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)基，洗滌2～3次，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)基。

3）黏附率檢測：96孔板每孔加入10 μL細(xì)胞染色液B，在37℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm各孔的吸光值（OD450值）。各重復(fù)孔的OD450值取平均數(shù)，計(jì)算細(xì)胞黏附率的公式如下：

1.2.4 透皮性實(shí)驗(yàn)

1）制樣：取制備好的離體豬皮，用擴(kuò)散池進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)。供給液分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。

2）組織切片：用4%多聚甲醛固定上述豬皮24 h，用自來水高流速?zèng)_洗12 h，后依次浸泡在75%、85%、95%Ⅰ、95%Ⅱ的乙醇中各1 h，進(jìn)行脫水處理。然后浸泡于1∶1的無水乙醇及二甲苯混合液中30 min，二甲苯Ⅰ中15 min，二甲苯Ⅱ中15 min，進(jìn)行透明化處理。再進(jìn)行浸蠟處理，分別浸泡于石蠟Ⅰ中1 h，石蠟Ⅱ中過夜，石蠟Ⅲ中1 h。用石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋，修蠟后，在-20℃的冰箱中過夜保存。最后，用切片機(jī)將切片橫向及縱向切成5 mm切片，40℃展片，62℃烤片。

3）天狼星紅染色：

①染色前先脫蠟：水，二甲苯Ⅰ中10 min，二甲苯Ⅱ中10 min，無水乙醇Ⅰ中2 min，無水乙醇Ⅱ中2 min，95%乙醇2 min，85%乙醇2 min，75%乙醇2 min，流水沖洗。

②染色時(shí)用weigert鐵蘇木素染色液將組織切片染色10～20 min，自來水沖洗5～10 min，用蒸餾水清洗1次。隨后使用天狼星紅染液染色1 h，流水沖洗后，去除染液。

③染色后脫水，浸泡于95%Ⅰ、95%Ⅱ的乙醇中各5 min，無水乙醇Ⅰ中5 min，無水乙醇Ⅱ中5 min，二甲苯Ⅰ中5 min，二甲苯Ⅱ中5 min透明。

④將中性樹膠滴于載玻片組織上，用蓋玻片覆蓋，覆蓋時(shí)應(yīng)先接觸一邊，后逐漸覆蓋，可有效避免產(chǎn)生氣泡。

4）顯微鏡觀察拍照：在普通光學(xué)顯微鏡下，觀察分析實(shí)驗(yàn)組和對照組在顯微鏡下的組織切片，并拍照。紅色為膠原纖維，藍(lán)色為細(xì)胞核，黃色為肌纖維。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)

2.1.1 RHC促進(jìn)細(xì)胞生長的起效量實(shí)驗(yàn) 對比各組細(xì)胞生長，分析RHC促進(jìn)成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞生長的最低起效量濃度。圖1結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的生長趨勢相似。與對照組相比，當(dāng)RHC濃度≥0.0025%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組均可促進(jìn)細(xì)胞的生長；而當(dāng)RHC濃度＜0.0025%時(shí)，其生長情況與對照組大致相同。這證明RHC促進(jìn)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞）生長的起效量為0.0025%。

2.1.2 RHC與市售普通膠原蛋白1、2對比實(shí)驗(yàn)本文選用RHC濃度為0.01%，該濃度可促進(jìn)細(xì)胞生長，采用實(shí)驗(yàn)方法1.1.2得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，RHC組的細(xì)胞生長速率明顯快于市售普通膠原蛋白1、2組，表明RHC促進(jìn)細(xì)胞生長的性能優(yōu)于市售普通膠原蛋白1、2。

2.1.3 表皮細(xì)胞生長形態(tài)學(xué)變化 如圖3所示，在倒置顯微鏡下，接種1 d，各組表皮細(xì)胞呈球形，大小均勻，邊界清晰；在接種2～4 d內(nèi)，細(xì)胞逐漸貼壁生長，形狀呈眼球形，可觀察到細(xì)胞核，細(xì)胞數(shù)量快速增長并連接成片狀，各組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異；與空白對照組比，其他各組細(xì)胞增長量明顯，其中RHC組表皮細(xì)胞密度最大，分布均勻。

2.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞整體遷移距離，分析RHC及其他樣品促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力。

本實(shí)驗(yàn)主要為劃痕實(shí)驗(yàn)，通過顯微鏡觀察不同時(shí)間內(nèi)“傷口”的愈合程度，即細(xì)胞的遷移（圖4）。圖5統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，RHC組在6 h的細(xì)胞遷移距離大于其他組在24 h的遷移距離，而24 h后，RHC組的細(xì)胞遷移距離遠(yuǎn)高于其他對照組，證明RHC促進(jìn)細(xì)胞遷移能力優(yōu)于市售普通膠原蛋白。

此外，本研究還采用以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為代表的單層體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停▽?shí)驗(yàn)方法中未體現(xiàn)這部分），測定了2種化妝品原料（海洋膠原蛋白）體外促進(jìn)創(chuàng)面愈合的能力。在體外系統(tǒng)中，通過產(chǎn)品促進(jìn)損傷組織愈合的能力評價(jià)修復(fù)效果。

以0.1%濃度為例，在相同時(shí)間內(nèi)，RHC的細(xì)胞修復(fù)能力比海洋膠原蛋白更加突出。圖6數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)過t檢驗(yàn)，2 h后RHC組細(xì)胞遷移變化率呈顯著性差異，且24 h后RHC的細(xì)胞修復(fù)比海洋膠原蛋白高21.1%。因此，RHC在細(xì)胞修復(fù)方面的效果比海洋膠原蛋白更加顯著，且起效速度更快，2 h內(nèi)即有顯著效果。

2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 根據(jù)各組的黏附率，分析并比較RHC與市售普通膠原蛋白1、2及RGD肽的細(xì)胞黏附能力。

如表1所示，RHC的促細(xì)胞黏附性能明顯優(yōu)于市售普通膠原蛋白，且RHC促細(xì)胞黏附性能與濃度相關(guān)，RHC濃度越大，細(xì)胞黏附增強(qiáng)，這一性質(zhì)對不同種類的細(xì)胞無較大差異。當(dāng)RHC濃度達(dá)到0.05%時(shí)，細(xì)胞黏附率已高達(dá)45%，根據(jù)已報(bào)導(dǎo)文獻(xiàn)[9]：細(xì)胞黏附率大于40%說明材料已具有優(yōu)良的細(xì)胞黏附性能。

表1 不同濃度RHC的細(xì)胞黏附情況匯總（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.4 透皮性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 皮膚中RHC的吸收利用情況 通過對照組與實(shí)驗(yàn)組的染色，比較2組內(nèi)表皮RHC含量。由內(nèi)表皮RHC含量差異，得出皮膚中RHC的吸收利用量。

在顯微鏡下觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組的切片并拍照（圖7），可發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中紅色所占面積更大，表明涂抹過RHC溶液的豬皮中膠原蛋白含量更多，即豬皮吸收了一定的RHC溶液，使其膠原蛋白含量上升，高于動(dòng)物膠原蛋白對照組。

2.4.2 RHC在皮膚深度方向上的吸收量分布由實(shí)驗(yàn)組與對照組不同深度處的染色顯色差異，可分析皮膚不同深度對于膠原蛋白的吸收情況。

實(shí)驗(yàn)組中不同深度的組織切片，紅色分布較為一致，顏色不隨深度的變化而變化（圖8）。對照組中，顏色亦不隨深度的變化而改變。但在不同深度下，實(shí)驗(yàn)組的紅色分布多于對照組，這說明在一定時(shí)間后，豬皮在吸收RHC后可達(dá)到一個(gè)平衡的狀態(tài)，其吸收的膠原蛋白分布均勻。

圖9顯示，實(shí)驗(yàn)組縱向紅色分布較為均勻，顏色不隨縱向位置的不同而發(fā)生較大變化，結(jié)果與圖7一致。而對照組（10倍濃度動(dòng)物膠原）中，顏色隨縱向位置的不同有較大的變化，證明動(dòng)物膠原在皮膚中滲透是不均一的；隨著濃度增加（100倍濃度動(dòng)物膠原），染料顏色加深，說明動(dòng)物膠原透過皮膚的量增加。但同實(shí)驗(yàn)組比（從縱向及橫向2個(gè)方面），動(dòng)物膠原的滲透性能是弱于RHC的。本實(shí)驗(yàn)證明，RHC具有更強(qiáng)的透皮性能，且在皮膚的分散性更均勻。

3 討論

細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)中，RHC促進(jìn)細(xì)胞生長的起效量為0.0025%，優(yōu)于市售普通膠原蛋白。重組膠原蛋白比普通膠原蛋白在分子量方面具有一定優(yōu)勢，有研究表明，膠原蛋白分子量為1 500～3 000 Da時(shí)，更容易被人體吸收利用。重組膠原蛋白在基因構(gòu)建時(shí)，可通過控制氨基酸含量實(shí)現(xiàn)小分子量重組膠原蛋白的生產(chǎn)。本研究所用重組膠原蛋白分子量約2 000 Da，相比于市售的大分子膠原蛋白，重組膠原蛋白在促進(jìn)細(xì)胞生長方面具有明顯優(yōu)勢。

促細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h內(nèi)，RHC促進(jìn)細(xì)胞遷移能力優(yōu)于市售普通膠原蛋白；細(xì)胞黏附性方面，RHC濃度越高，黏附性越強(qiáng)；與動(dòng)物膠原蛋白相比，RHC具有更優(yōu)異的透皮性能。重組膠原蛋白具有與普通膠原蛋白相同的三螺旋結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，本研究所用重組膠原蛋白在構(gòu)建過程中加入了更多的親水性基團(tuán)與活性基團(tuán)，這些基團(tuán)有效提高了重組膠原蛋白的親水性與生物活性。親水性基團(tuán)可與皮膚中的水分結(jié)合達(dá)到保濕效果，也有效增強(qiáng)了細(xì)胞黏附性。同時(shí)強(qiáng)活性使得重組膠原蛋白具有強(qiáng)滲透性，可透過角質(zhì)層與皮膚上層細(xì)胞結(jié)合，參與和改善皮膚細(xì)胞的代謝，增強(qiáng)皮膚中原有膠原蛋白的活性。因此，重組膠原蛋白在促細(xì)胞遷移、促細(xì)胞黏附與透皮性方面都展現(xiàn)出優(yōu)于普通膠原蛋白的性能。綜上，從生物相容性方面分析，RHC展現(xiàn)出的優(yōu)良性能，為其在表皮修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能性。

總體上，重組膠原蛋白應(yīng)用前景廣闊，其高穩(wěn)定性、易擴(kuò)大生產(chǎn)、高生物相容性等特點(diǎn)均是其作為組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品的實(shí)施基礎(chǔ)，研究者也將重組膠原蛋白用于創(chuàng)面修復(fù)、角膜替代物等再生醫(yī)療領(lǐng)域，已取得了一定的臨床效果[10-14]，故對重組膠原蛋白的開發(fā)研究在未來依然是生物材料領(lǐng)域熱點(diǎn)研究方向之一。