孟祥彩，劉 洋，武 玉，劉振方，王益民

(1.秦皇島市第一醫(yī)院，河北 秦皇島 066000；2.石家莊市中醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)腸癌是僅次于肺癌、肝癌的全球第三大常見惡性腫瘤[1]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球結(jié)直腸癌男性、女性發(fā)病率分別為第3位、第2位，而死亡人數(shù)均居癌癥第3位[1-2]。我國結(jié)直腸癌的新發(fā)病人數(shù)僅次于肺癌，已成為第二大惡性腫瘤[3]。由于結(jié)腸癌患者早期癥狀一般不明顯，因而結(jié)腸癌患者一經(jīng)診斷往往為中晚期[4]。雖然，傳統(tǒng)治療方式和新興治療方法在一定程度上延長了患者生存周期，但多數(shù)患者最終仍死于結(jié)腸癌及其并發(fā)癥。因此，臨床治療結(jié)腸癌的有效手段有待進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。

中醫(yī)理論認(rèn)為，結(jié)腸癌屬于“腸風(fēng)臟毒”“下痢”，多數(shù)由人體正氣虛弱，無力抗邪，淤、氣、毒，留滯結(jié)腸，日久形成“腸風(fēng)臟毒”[5]。中藥黃芩性寒，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效，對腸癌等多種腫瘤具有一定療效。黃芩素是從黃芩中提取的黃酮類化合物，已被證實(shí)是黃芩抗腫瘤功效的重要化合物[6-7]。黃芩素能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。在結(jié)腸癌相關(guān)研究中，黃芩素可抑制細(xì)胞增殖、克隆形成及細(xì)胞遷移等惡性生物學(xué)行為[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素在惡性腫瘤放化療增敏中發(fā)揮一定作用，但黃芩素對結(jié)腸癌化療敏感性的影響及相關(guān)機(jī)制還不完全清楚[10-11]。本研究以結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞作為研究對象，觀察黃芩素預(yù)處理在伊立替康抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖中的作用，并對相關(guān)信號機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床治療結(jié)腸癌提供實(shí)驗支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗細(xì)胞和藥品：人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞(南京科佰生物科技有限公司)；黃芩素(純度98%，Sigma Aldrich公司)。

1.1.2 實(shí)驗試劑：MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(批號20201225，北京索萊寶公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(批號C11875500CP)、胎牛血清(批號2132094P)、胰蛋白酶(批號2152875)均為美國Gibco公司制品；PVDF膜(美國Millipore公司)；Src抗體(批號6)、p-Src抗體(批號3)、Yes相關(guān)蛋白(Yes-related protein，YAP)抗體(批號26)、p-YAP抗體(批號16)、大腫瘤抑制因子激酶1(Large tumor suppressor kinase 1，LATS1)抗體(批號9)、p-LATS1抗體(批號18)、GAPDH抗體(批號5)、羊抗兔IgG-HRP抗體(批號28)均為美國Cell Signaling Technology公司制品。

1.1.3 實(shí)驗儀器：spectraMaxM5酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；CKX53倒置顯微鏡和IXPLORE Live倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；GelDocXR凝膠成像儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HT-29細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測HT-29細(xì)胞增殖能力：HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至70%～90%匯合度時進(jìn)行鋪板。收集細(xì)胞并將細(xì)胞重懸至40000個/ml。96孔板每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日，以50、100、200 μmol/L黃芩素預(yù)處理細(xì)胞12 h后，以梯度濃度伊立替康(0.5、1、5、10、50 μmol/L)處理細(xì)胞24 h。向細(xì)胞中加入20 μl MTT(5 mg/ml)置于培養(yǎng)箱孵育4 h。吸出培養(yǎng)液，加入200 μl二甲基亞砜輕微震蕩，在spectraMaxM5酶標(biāo)儀中檢測吸光度值。

1.2.3 平板克隆實(shí)驗檢測細(xì)胞克隆形成能力：將HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至70%～90%匯合度，收集細(xì)胞并將部分細(xì)胞以全培養(yǎng)基稀釋至200個/ml。吸取3 ml細(xì)胞懸液至6孔板中培養(yǎng)過夜。次日，以50、100、200 μmol/L黃芩素預(yù)處理細(xì)胞12 h后，以5 μmol/L伊立替康處理細(xì)胞24 h。更換新的全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d，依次以4%多聚甲醛和0.1%結(jié)晶紫染色對細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。拍照記錄每個處理組細(xì)胞克隆情況。

1.2.4 Western blotting法檢測p-Src、p-YAP和p-LATS1蛋白表達(dá)水平：細(xì)胞以50、100、200 μmol/L黃芩素處理24 h后以RIPA裂解液裂解細(xì)胞以提取總蛋白。各處理組總蛋白以BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)定量濃度制備電泳蛋白樣品，蛋白濃度為30 μg或10 μl。采用10% SDS-PAGE電泳將總蛋白分離，并采用轉(zhuǎn)膜技術(shù)將分離蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后孵育p-Src(1∶1000)、Src(1∶2000)、YAP(1∶1000)、p-YAP(1∶500)、p-LATS1(1∶500)、LATS1(1∶2000)及GAPDH(1∶1000)過夜；次日，洗去各一抗后以羊抗兔IgG-HRP抗體孵育1 h，洗去二抗后以ECL化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像儀下進(jìn)行成像。

1.2.5 免疫熒光實(shí)驗檢測YAP蛋白表達(dá)分布:將細(xì)胞接種于置有蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)過夜；次日，以200 μmol/L黃芩素組處理細(xì)胞24 h，以4%多聚甲醛、Triton X-100及5%牛血清白蛋白分別處理細(xì)胞2個10 min及2 h，而后孵育YAP抗體(1∶600)過夜；次日，洗去一抗后滴加熒光二抗(1∶250)避光孵育1 h，洗去二抗并用含DAPI的抗熒光猝滅液封片，于熒光顯微鏡下成像拍照。

2 結(jié) 果

2.1 各組對伊立替康抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用比較 MTT結(jié)果顯示(圖1)，50 μmol/L黃芩素組、100 μmol/L黃芩素組、200 μmol/L黃芩素組均能增加伊立替康對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用(P<0.05)，并存在劑量依賴性。

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

2.2 各組對伊立替康抑制結(jié)腸癌細(xì)胞克隆作用比較 平板克隆實(shí)驗顯示(圖2)，對照組、50 μmol/L黃芩素組、100 μmol/L黃芩素組、200 μmol/L黃芩素組的克隆形成率分別為100%、(67.6±6.5)%、(39.2±5.1)%、(12.3±3.1)%。與對照組相比，50 μmol/L黃芩素組、100 μmol/L黃芩素組、200 μmol/L黃芩素組的HT-29細(xì)胞克隆形成率均低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且與黃芩素濃度成反比。

圖2 各組對伊立替康抑制HT-29細(xì)胞克隆作用

2.3 各組HT-29細(xì)胞p-Src蛋白表達(dá)比較 見表1(圖3)。與對照組相比，50 μmol/L黃芩素組、100 μmol/L黃芩素組、200 μmol/L黃芩素組p-Src蛋白表達(dá)均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且呈劑量依賴性。

表1 各組HT-29細(xì)胞p-Src蛋白表達(dá)比較(%)

圖3 各組HT-29細(xì)胞p-Src蛋白電泳圖

2.4 各組HT-29細(xì)胞p-YAP、p-LATS1蛋白表達(dá)比較 見表2(圖4)。與對照組比較，50 μmol/L黃芩素組、100 μmol/L黃芩素組、200 μmol/L黃芩素組p-YAP和p-LATS1蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且呈劑量依賴性。

表2 各組HT-29細(xì)胞p-YAP和p-LATS1蛋白表達(dá)比較(%)

圖4 各組HT-29細(xì)胞p-YAP和p-LATS1蛋白電泳圖

2.5 各組細(xì)胞質(zhì)YAP蛋白表達(dá)比較 對照組細(xì)胞YAP蛋白以細(xì)胞核表達(dá)為主，而200 μmol/L黃芩素組細(xì)胞YAP蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均可見明顯表達(dá)，見圖5。

圖5 各組HT-29細(xì)胞YAP蛋白表達(dá)(免疫熒光染色，×100)

3 討 論

中草藥治療是中醫(yī)內(nèi)治的主要方法，是我國傳統(tǒng)治療的重要手段。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)體系的引入，中草藥的治療機(jī)制并不能以明確的西醫(yī)治療機(jī)制完全解釋。近年來對中草藥復(fù)合成分進(jìn)行提取、分離和鑒定，以及相關(guān)機(jī)制研究，在一定程度上解釋了中醫(yī)藥治療的潛在藥理機(jī)制。一些中草藥提取物如青蒿素[12]、紫杉醇[13]、秋水仙素[14]等單體化合物，具有明確的作用機(jī)制和較好的治療效果，已在臨床上廣泛應(yīng)用。

黃芩素是從中藥黃芩中提取的黃酮類化合物[5]。研究顯示，黃芩素能誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡，而該作用可能與Caspase-3依賴性通路有關(guān)[15]。還有研究顯示，黃芩素及其代謝產(chǎn)物黃芩苷可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480細(xì)胞周期阻滯，并抑制克隆形成和遷移，上述作用是通過抑制MAPK/ERK和p38信號通路完成的[9]。還有研究顯示，黃芩素可下調(diào)HT-29細(xì)胞STAT3、NF-κB蛋白表達(dá)，并上調(diào)P53蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和遷移[16]，提示黃芩素在結(jié)腸癌中可能通過多種途徑抑制細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。在本研究中，黃芩素可增強(qiáng)伊立替康對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖、克隆，形成抑制作用，提示黃芩素能增強(qiáng)HT-29細(xì)胞對伊立替康的敏感性。

Src是一種非受體蛋白絡(luò)氨酸激酶，在細(xì)胞運(yùn)動、增殖及存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Src激酶在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮積極作用。Src能通過ANXA2/STAT3 信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素誘導(dǎo)Src激酶磷酸化，發(fā)揮增強(qiáng)伊立替康對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用。最近的研究顯示，Src 激酶參與調(diào)節(jié) YAP 的去磷酸化而調(diào)控細(xì)胞增殖[19]。一項對腸上皮細(xì)胞的研究表明，gp130 通過 Src 誘導(dǎo) YAP 核轉(zhuǎn)位，從而誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞增殖[20]。在本研究中黃芩素通過Src調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞對伊立替康增敏可能與YAP有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素能明顯誘導(dǎo)LATS1、YAP磷酸化，并增加YAP的細(xì)胞質(zhì)分布，提示黃芩素可能通過抑制Src磷酸化而誘導(dǎo)LATS1/YAP磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，減少YAP進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞增殖。