陳釗銘，李征途，葉 楓

人類利用呼出氣診斷疾病具有十分悠久的歷史，古希臘的希波克拉底（公元前460—370 年）首次描述了傷寒與呼出氣的關(guān)系。18 世紀(jì)末，安托萬·拉瓦錫發(fā)明了現(xiàn)代呼氣檢測方法，從而發(fā)現(xiàn)了氧氣和二氧化碳，取代了燃素理論[1]。20 世紀(jì)80 年代13C-尿素呼氣試驗(yàn)首次用于幽門螺桿菌感染的診斷。經(jīng)過30 年的發(fā)展，尿素呼氣試驗(yàn)已被認(rèn)為是診斷幽門螺桿菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。2011 年，美國胸科協(xié)會(huì)制定了呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，F(xiàn)eNO）測定作為一種無創(chuàng)方法來診斷哮喘和監(jiān)測抗炎治療療效的應(yīng)用指南，并強(qiáng)烈建議使用FeNO測定診斷嗜酸性氣道炎癥[3]。呼出氣揮發(fā)性有機(jī)物（VOC）檢測作為一種新型生物標(biāo)志物分析方法，促進(jìn)了呼出氣代謝組學(xué)在臨床中的應(yīng)用與發(fā)展[4]。

1 呼出氣VOC 檢測應(yīng)用于肺部感染診斷的原理和方法

人體VOC 的產(chǎn)生與自身新陳代謝有著密切聯(lián)系，機(jī)體在患病狀態(tài)下，某些代謝通路增強(qiáng)或減弱可導(dǎo)致細(xì)胞及周圍環(huán)境的pH 值發(fā)生改變，為了維持內(nèi)環(huán)境平衡，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，即VOC 進(jìn)行中和[5]。血液中的VOC 能通過氣體交換經(jīng)血?dú)馄琳系竭_(dá)肺泡，因此肺泡VOC 的濃度可代表血液中的濃度[6]。有學(xué)者推測，肺部感染性疾病患者產(chǎn)生的VOC 可能來自3 個(gè)方面：宿主生理代謝過程的產(chǎn)物、微生物病原體代謝過程的產(chǎn)物以及宿主抵抗病原體產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程的產(chǎn)物[7]。

呼出氣VOC 檢測技術(shù)依賴于近年來質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，主要檢測方法可分為直接分析檢測和離線分析檢測。直接分析法所用質(zhì)譜技術(shù)包括質(zhì)子轉(zhuǎn)移質(zhì)譜、選擇性離子流動(dòng)管質(zhì)譜、離子遷移譜、激光光譜技術(shù)、電子鼻技術(shù)等。直接分析法可連續(xù)監(jiān)測VOC 的動(dòng)態(tài)變化，不需要預(yù)先濃縮或儲(chǔ)存呼吸樣品，且成本較低。其局限性在于檢測范圍有限，不支持絕對識(shí)別，例如雖然離子遷移譜可根據(jù)呼出氣成分在電場的行為來識(shí)別其成分，電子鼻技術(shù)可通過各種排列分布傳感器識(shí)別信號的改變來區(qū)分患者與健康人，但均不能識(shí)別單個(gè)化合物；選擇性離子流動(dòng)質(zhì)譜同樣不能辨別同分異構(gòu)體。

離線分析法中氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）是呼出氣VOC 檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其不僅可以分離出呼出氣VOC，還可精確進(jìn)行辨別和定量，但該機(jī)器體積龐大且價(jià)格高昂，難以實(shí)現(xiàn)床旁快速檢測。此外，間接分析方法還需要解決樣品采集問題，如需對全部氣體成分進(jìn)行分析，可使用Tedlar 氣袋或金屬罐進(jìn)行采樣。Tedlar 氣袋可重復(fù)利用，不易泄露，但僅可保存數(shù)小時(shí)；金屬容器密閉性更好，保存時(shí)間長，但成本過高且難以清洗。如只需對部分類別的化合物進(jìn)行靶向分析，通常采用預(yù)濃縮的方法進(jìn)行檢測，如熱解析法、固相微萃取、分子過濾篩等方法，這些方法亦存在碎片化、靈敏度不高、難以定量等問題[5，8-9]。

2 各種病原體呼出氣VOC 檢測的研究進(jìn)展

2.1 細(xì)菌

基礎(chǔ)研究方面，Bean 等[10]采用二次電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等產(chǎn)生的特異性VOC 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)病原體自身能產(chǎn)生部分特異性VOC，且這些VOC 與宿主的免疫應(yīng)答有關(guān)。通過體內(nèi)、體外VOC 二次電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)指紋圖譜比較，發(fā)現(xiàn)存在一定的差異性[11-12]。Lawal 等[13]利用人工痰液和營養(yǎng)液培養(yǎng)菌，對其頂空進(jìn)行采樣后通過熱解析氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（TD-GC-MS）分析VOC，識(shí)別出此前報(bào)道的揮發(fā)性標(biāo)志物吲哚和1-十一烯，并檢測到新發(fā)現(xiàn)的化合物環(huán)戊酮和1-己醇。研究者進(jìn)一步研究了培養(yǎng)基成分，以確定培養(yǎng)基對于VOC 產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示在不同培養(yǎng)環(huán)境下，細(xì)菌產(chǎn)生的VOC 存在差異。此外，研究者對A549 Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞株分別在有和無銅綠假單胞菌的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，并利用過氧化氫培養(yǎng)A549 細(xì)胞，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，研究上皮細(xì)胞損傷產(chǎn)生的標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的VOC 標(biāo)志物主要為乙醚基化合物[14]。

臨床研究方面，研究者利用GC-MS 檢測肺部感染患者呼出氣VOC，發(fā)現(xiàn)呼出氣VOC 能有效區(qū)分肺部感染患者與非感染者。Filipiak 等[15-17]進(jìn)行的一項(xiàng)開放性隨機(jī)臨床試驗(yàn)，招募了28 例患嚴(yán)重顱內(nèi)疾病的機(jī)械通氣患者，發(fā)現(xiàn)感染金黃色葡萄球菌或白念珠菌患者的呼出氣VOC 與前期體外研究中相應(yīng)病原體釋放的代謝物重疊，其濃度分布與感染過程相關(guān)。Neerincx 等[18]亦發(fā)現(xiàn)呼出氣VOC 譜可區(qū)分感染與非感染肺囊性纖維化患者，并確定了9 種有鑒別意義的重要化合物。有學(xué)者對感染鮑曼不動(dòng)桿菌的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎患者的呼出氣樣本進(jìn)行分析，結(jié)果表明通過VOC 譜可以區(qū)分患者下呼吸道鮑曼不動(dòng)桿菌的存在與否，及鮑曼不動(dòng)桿菌的感染與定植[19]。這些研究顯示，將代謝生物標(biāo)志物從細(xì)胞體外研究和動(dòng)物模型體內(nèi)研究轉(zhuǎn)移到人體研究是可行的，但在臨床使用之前需要進(jìn)一步完善和驗(yàn)證。

2.2 病毒

病毒VOC 檢測目前仍限于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。一些學(xué)者通過GC-MS 檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒[20-21]、呼吸道合胞病毒等感染細(xì)胞后產(chǎn)生的VOC，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞產(chǎn)生的VOC 中，以酯和其他含氧化合物為主，可能與感染引起的炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激增加相關(guān)。

Schivo 等[22]將感染鼻病毒的人支氣管原代上皮細(xì)胞、熱滅活的鼻病毒和Toll 樣受體（TLR）激動(dòng)劑poly（I：C）處理的細(xì)胞與對照組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示受感染細(xì)胞中脂族醇、支鏈烴和二甲基硫化物等化合物存在差異表達(dá)，這些化合物可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。但單純的TLR3 激動(dòng)劑無法激活細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)物質(zhì)，提示這些標(biāo)志物的產(chǎn)生與病毒復(fù)制相關(guān)。

Traxler 等[23]通過GC-MS 對甲型流感病毒感染豬分別在感染前、感染期、康復(fù)后對其呼出氣VOC 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乙醛、丙醛、乙酸正丙酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯和1，1-二丙基丙烷等6種VOC 可能與疾病進(jìn)展有關(guān)。在接種病毒后的第4 天，感染組檢測到甲型流感病毒陽性時(shí)，對照組與感染組的呼出氣VOC 呈現(xiàn)差異。

2.3 曲霉

2-戊基呋喃被認(rèn)為是曲霉感染患者呼出氣VOC 中極為重要的標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，曲霉在血瓊脂、營養(yǎng)瓊脂和其他培養(yǎng)基上培養(yǎng)可產(chǎn)生2-戊基呋喃[24]。在隨后的一項(xiàng)前瞻性觀察研究中，通過GC-MS 檢測有侵襲、定植曲霉風(fēng)險(xiǎn)的慢性肺部疾病患者及健康人呼吸樣本中的2-戊基呋喃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-戊基呋喃呼氣試驗(yàn)的靈敏度和特異度為77%和78%[25]。有報(bào)道顯示2 例嚴(yán)重免疫抑制的侵襲性肺曲霉病患者，在其多個(gè)呼出氣樣本中檢測到2-戊基呋喃，但經(jīng)過有效治療后未再檢測到2-戊基呋喃[26]。此外，萜類化合物亦受到人們關(guān)注，Koo 等[27]通過TD-GC-MS 對曲霉進(jìn)行體內(nèi)、體外呼氣試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單萜類化合物α-和β-蒎烯、檸檬烯，倍半萜化合物α-和β-反式香檸檬烯是煙曲霉獨(dú)特的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。Gerritsen 等[28]對曲霉臨床分離株和標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)一步利用GC-MS 對其培養(yǎng)基樣品進(jìn)行分析，同時(shí)對患者呼出氣VOC 進(jìn)行檢測，并將二者的結(jié)果進(jìn)行比較，由曲霉感染可產(chǎn)生1，3-戊二烯、2-甲基-1-丙醇和2-甲基異莰醇等代謝產(chǎn)物。值得注意的是，上述研究中的呼出氣樣本和培養(yǎng)物中均未檢測到2-戊基呋喃，有學(xué)者認(rèn)為2-戊基呋喃可能來源于血紅蛋白，由培養(yǎng)基中的血瓊脂或者患者肺出血產(chǎn)生，而不是來自真菌本身。生長培養(yǎng)基或分離物的不同亦將導(dǎo)致檢測到的VOC 存在差異，例如只有在培養(yǎng)基中添加彈性蛋白時(shí)才能檢測到倍半萜類化合物。事實(shí)證明真菌產(chǎn)生VOC 是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程[29]，因此需要在不同時(shí)間點(diǎn)采用多種 VOC 組合的方式進(jìn)行檢測，才能更好地將體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。

3 呼出氣VOC 應(yīng)用于肺部感染病原體檢測的前景

傳統(tǒng)的病原體檢測方法如培養(yǎng)、血清學(xué)和分子檢測等常需耗費(fèi)數(shù)小時(shí)到數(shù)天，甚至需要復(fù)雜、有創(chuàng)的采樣技術(shù)，如支氣管肺泡灌洗。因此，呼出氣VOC 的檢測作為一種無創(chuàng)、快速、靈敏的檢測方法，具有一定的應(yīng)用前景。但仍然存在以下問題需要解決：①背景空氣及其個(gè)體差異對呼吸成分的影響，這需要更加嚴(yán)格地做好參照及采樣的質(zhì)量控制；②現(xiàn)階段研究仍缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同設(shè)備之間一致性及真實(shí)性尚需考證；③體內(nèi)外研究結(jié)果的明顯差異也提示仍需要對呼出氣VOC的產(chǎn)生來源作一步探索。未來呼出氣VOC 可作為識(shí)別肺部感染病原體的標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，但需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。