郭儒爵 綜述，李才明 審校

(1.廣東醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 湛江 524000；2.廣東醫(yī)科大學惠州市第一臨床醫(yī)學院，廣東 惠州 516000)

基質金屬蛋白酶(MMPs)屬于鈣依賴性的鋅內肽酶家族，其主要作用是降解細胞外基質，作為一類炎癥介質對許多疾病發(fā)生、發(fā)展過程產生影響。在急性腦梗死發(fā)生后，炎癥機制所介導的神經損傷正受到眾多研究者的關注?；|金屬蛋白酶-9(MMP-9)不僅與急性腦梗死發(fā)病風險相關，還與卒中后缺血性腦損傷、血腦屏障的破壞、腦水腫、缺血再灌注損傷、出血轉化、晚期組織修復等病理生理過程存在密切聯(lián)系。目前，臨床上主要通過時間窗內血管再通治療挽救缺血腦組織，而應用神經保護類藥物治療缺血性腦卒中的效果仍十分有限。本文就近年來關于MMP-9與腦梗死的研究展開綜述，探究通過調節(jié)MMP-9治療缺血性腦卒中的策略。

1 MMP-9

MMPs家族至少由26個結構與功能相關的成員組成[1]，所有成員都具有多個共同的結構域，尤其是一個高度保守的催化位點，該催化結構域由一個鋅離子結合的相同氨基酸序列組成。根據(jù)其一級結構和底物特異性，MMPs可分為膠原酶(MMP-1、MMP-8和MMP-13)、明膠酶(MMP-2和MMP-9)、基質蛋白酶(MMP-3、MMP-10和MMP-11)、微量MMPs(MMP-7和MMP-26)和膜型MMPs(MT-MMPs)[2]。一些MMPs是膜結合的，而另一些則通過與特定的細胞外基質成分相互作用留在細胞間隙中。這種間隔化將基質金屬蛋白酶活性集中在細胞間隙的底物上[2]。MMPs在正常的生理過程中發(fā)揮作用，包括組織形態(tài)發(fā)生、細胞遷移和血管生成，還參與傷口愈合、炎癥和癌癥等病理生理過程[3]。MMP-9是一種由中性粒細胞、小膠質細胞和內皮細胞等誘導表達的92 kDa MMP，參與細胞外基質的重塑。在MMPs家族，MMP-9是在急性腦梗死中被研究的最為廣泛的一種酶[4-5]。

2 MMP-9的異常表達與心血管疾病相關

MMPs活性在正常生理條件下幾乎未檢測到，但在某些發(fā)育、生理和病理過程中表現(xiàn)出明顯的活性[2]。據(jù)文獻報道，MMP-9的表達與活性在頸動脈粥樣斑塊內增加，與斑塊內出血相關，影響斑塊的穩(wěn)定性[6-8]。MMP-9可能促進斑塊內新生血管生成，誘導巨噬細胞和平滑肌細胞的增殖和遷移[9]及細胞外基質的降解，其中細胞外基質成分的降解，包括彈性蛋白、膠原和纖維蛋白，導致纖維帽變薄[8]，從而增加斑塊破裂和斑塊內出血的風險[6]，而MMP-9表達缺失可抑制斑塊炎癥，防止斑塊不穩(wěn)定[8]。存在不穩(wěn)定性動脈粥樣硬化斑塊患者MMP-9水平升高，循環(huán)MMP-9可作為預測斑塊破裂的生物標志物之一[10]。相對于冠心病穩(wěn)定期，急性心肌梗死患者循環(huán)中存在更多的MMP-9[11]，MMP-9的酶活性隨著心肌梗死的嚴重程度而增加，MMP-9 的增加與斑塊不穩(wěn)定性、更大面積的心肌梗死、左心室功能受損及 ST 段抬高的急性心肌梗死的致命臨床演變直接相關[12]。MMP-9參與糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[13]。在腦實質出血的死亡患者中發(fā)現(xiàn)血腫周圍組織呈強的MMP-9免疫組化反應[14]。目前，有研究證據(jù)也表明MMP-9不僅可能與急性腦梗死發(fā)病風險相關，而且以多種機制參與了急性腦梗死發(fā)生后腦損傷的病理生理過程。

2.1MMP-9可能與急性腦梗死發(fā)病風險相關 卒中是在世界范圍導致死亡和殘疾的主要原因，治療和中風后護理的經濟成本很高[15]。急性缺血性腦卒中(腦梗死)是最常見的腦卒中類型，占全部腦卒中的60%～80%[16]。眾所周知，缺血性卒中是由一系列危險因素和不良生活方式引起的，包括高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、飲酒和吸煙等。此外，遺傳因素與缺血性中風的發(fā)生有關。越來越多的證據(jù)表明炎癥在缺血性卒中易感性中起著重要作用，而MMPs是炎癥細胞所產生的一種炎癥介質[17]。ZHAO等[9]在國內進行的一項病例對照研究，納入了335例缺血性卒中患者和335例健康對照者，結果顯示MMP-9基因rs3918242多態(tài)性與缺血性腦卒中風險增加相關，多因素logistic回歸分析顯示MMP-9 rs3918242的CC基因型與TT基因型相比，缺血性卒中的危險性顯著增加(OR=5.47,95%CI:2.64～12.38)，該基因多態(tài)性還與體重指數(shù)(BMI)在缺血性卒中風險中存在交互作用。目前，有學者認為MMP-9 rs3918242位點基因多態(tài)性與缺血性卒中的風險及疾病嚴重程度可能相關，但相關研究的結果和結論尚不一致[18]。缺血性卒中常發(fā)生在頸動脈狹窄和易破損動脈粥樣硬化斑塊的患者中，MMP-9促進頸動脈粥樣斑塊的形成、增加斑塊破裂的風險[6]。頸動脈斑塊中MMP-9的表達增高與斑塊不穩(wěn)定、狹窄程度高及癥狀性頸動脈閉塞性病變有關，尤其是在癥狀性狹窄的患者中[7]。斑塊內可檢測到MMP-9的存在，特別是在炎癥浸潤較強和細胞外基質區(qū)域，明顯高表達的細胞主要是巨噬細胞、泡沫細胞和淋巴細胞[7]。MMP-9促進斑塊發(fā)展的作用可能間接提高急性腦梗死的發(fā)病風險，但還需要更多的研究。

2.2缺血腦組織與外周血中MMP-9的活性與表達增加 在健康人的大腦中，MMP-9主要以酶原的形式存在[2]。在缺血性腦卒中發(fā)生后，無論是實驗動物或者患者中MMP-9的活性均顯著增高[19]，局部缺血腦組織中MMP-9表達增加[14,19-25]。研究結果表明，與非缺血性腦組織相比，缺血性損傷腦組織中觀察到MMP-9 表達顯著升高，主要在微血管及受損半球的神經元內，在受損組織中可以觀察到小膠質細胞激活的明確證據(jù)[14,21-22]。在梗死核心，MMP-9主要位于微血管周圍內皮細胞或周圍層，同時存在于血管周圍免疫反應性中性粒細胞。而在壞死實質部分可能由于細胞解體或稀疏，細胞內定位減少，在該區(qū)域內MMP-9陽性細胞主要為激活的小膠質細胞。在梗死灶周圍腦組織，陽性血管結構的豐度和強度與梗死組織相比降低[14]。由此可見，MMP-9的表達增加存在區(qū)域與細胞表達差異[14]。目前，關于哪些細胞在正常和病理性血腦屏障中釋放MMP-9仍然存在爭議[5]。缺血性腦損傷引起局部MMP-9的活性與表達增加的機制是復雜、多模式的，尚不完全清楚。缺血腦組織發(fā)生局部免疫反應，其中包括半暗帶內星形膠質細胞和小膠質細胞的快速激活[26]，內皮細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞等產生的MMP-9表達上調。腦缺血誘導激活了大量的信號級聯(lián)反應，引起MMP-9的激活[20]，炎性細胞因子釋放誘導MMP-9表達水平升高的能力已被廣泛證實[2]。聚合酶δ-相互作用蛋白-2、白細胞介素-17(IL-17)、腫瘤壞死因子-α、IL-1β、心血管活性肽、血管內皮生長因子等可通過p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2依賴的核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1、p42/p44MAPK、c-Jun氨基末端激酶、p65NF-κB等不同途徑促進MMP9的表達[18]。氧剝奪導致NO和ROS的產生也有助于氧化激活MMP-9[2]。

大量臨床與實驗研究證實，不僅缺血腦組織本身，外周血MMP-9的濃度同樣會增加[4-5,27]。在外周血液循環(huán)，單個核細胞則是MMP-9和內源性抑制因子(TIMP-1)的主要來源[4]。此外，中性粒細胞也可以在脫顆粒過程中釋放MMP-9[17]，不同的中性粒細胞產物，尤其是基質金屬蛋白酶(例如MMP-9)、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和髓過氧化物酶(MPO)存儲在不同中性粒細胞顆粒中，這些顆粒容易按需釋放，一旦被釋放和激活，這種酶能夠消化膠原和其他基質蛋白，從而促進炎癥組織的結構和功能損傷[28]。據(jù)報道，血漿MMP-9水平在卒中1 h出現(xiàn)早期升高，但在腦中未觀察到。相反，腦組織樣本顯示在48 h內MMP-9增加。這表明MMP-9的早期增加是由于外周來源，如單核細胞、中性粒細胞和血管內皮細胞。但也有報道認為，卒中2 h內腦組織MMP-9水平升高，但血漿MMP-9水平卻無此變化[29]。

2.3MMP-9損傷血腦屏障促進腦水腫與神經損傷 血腦屏障由緊密連接的內皮細胞、星形細胞末端足、周細胞、血管周圍小膠質細胞和細胞外基質組成[20]，包含3個對屏障完整性至關重要的結構:腦毛細血管內皮、內皮細胞之間的緊密連接和基底膜[3]。最近的研究強調了由腦內皮細胞、星形膠質細胞和神經元及細胞外基質組成的神經血管單位在維持卒中患者腦組織完整性方面的重要性，細胞外基質的紊亂會破壞微血管的動態(tài)平衡和完整性[30]。

MMPs是一類鋅依賴的蛋白酶家族，通常能裂解細胞外基質的所有成分，包括纖維連接蛋白、層粘連蛋白、蛋白多糖和Ⅳ型膠原[2-4,30]。構成緊密連接的蛋白是血腦屏障的主要組成部分之一，在封閉細胞外間隙中起著重要作用，對維持血腦屏障的整體完整性有重要貢獻[19,23]。MMPs是一類在病理條件下導致細胞間連接破裂的蛋白酶家族[23]。MMP-9通過降解Claudin-5、Occludin和ZO-1等參與血管內皮細胞間緊密連接的破壞，也降解主要的基底膜成分IV型膠原、層粘連蛋白[2,19,21,31]。LV等[32]發(fā)現(xiàn)通過對NF-κB-MMP-9信號傳導通路進行抑制可減輕Occludin、Claudin-5和ZO-1緊密連接蛋白的形態(tài)學改變。MMP-9導致細胞外基質降解、內皮細胞緊密連接喪失、毛細血管基底膜損傷，被認為是血腦屏障破壞的主要原因[21,25,33]。在腦缺血或再灌注過程中，MMP-9的作用也會導致產生了大量的氧化應激和神經炎癥，從而部分破壞血管神經單元結構[22]。在動物實驗中，往往通過Evans Blue外滲來評估血腦屏障的完整性與通透性，對實驗動物進行大腦中動脈閉塞，發(fā)生急性腦梗死后，毛細血管內皮細胞功能障礙與血腦屏障結構遭到破壞會導致血腦屏障通透性增加，相應腦組織Evans Blue染色增加[20,23,25,31]。血腦屏障通透性增加會引起血管源性腦水腫[4]。在中樞神經系統(tǒng)中，活化MMP-9的早期出現(xiàn)與局灶性腦缺血后血管源性水腫的形成有關[30]。在外周血中，MMP-9水平與活性同樣與腦水腫程度呈正相關。LI等[4]觀察到在急性腦梗死發(fā)生72 h內，血清MMP-9水平持續(xù)升高，MMP-9酶活性在12 h達到峰值，在不同時間點均高于對照組。血清MMP-9含量、mRNA水平、MMP-9酶活性均與腦含水量顯著相關(相關系數(shù)分別為0.371、0.557、0.761)。腦水腫可能在缺血性卒中的急性期開始，可持續(xù)數(shù)天，影響神經功能缺損的程度和恢復程度[19]。SOTGIU等[27]進行的一項小樣本[缺血性腦卒中組(n=50)，對照組(n=32)]臨床病例對照研究表明卒中初期患者血漿MMP-9的酶活性與卒中3個月時NIHSS評分和最終梗死面積大小直接相關，尤其與NIHSS評分較高的患者相關性更強，NIHSS評分高的患者MMP-9活性顯著高于評分低的患者。而通過基因敲除模型[34]或藥物治療[14,35]抑制MMP-9可以減少梗死體積，減輕缺血或再灌注引起的腦水腫。由此可見，MMP-9的上調與臨床神經功能缺損嚴重程度和腦梗死程度顯著相關。目前，仍缺乏關于血漿MMP-9與急性腦梗死關系的大樣本臨床研究。但有趣的是，MMP-9 雖可導致卒中期間的缺血性損傷，但事實上其也是缺血性事件后數(shù)天和數(shù)周內血運重建和恢復所必需的[36]，同時介導了在腦卒中后的組織修復和重塑[2,5,37]。

3 MMP-9表達與出血轉化

出血轉化(繼發(fā)性出血)影響部分缺血性卒中患者，是潛在的嚴重并發(fā)癥，溶栓治療是出血轉化的額外危險因素。當血腦屏障的完整性受損時，炎癥細胞和液體可以穿透大腦，導致血管源性水腫和出血轉化。而MMP-9通過破壞血腦屏障，增加血管源性水腫及提高隨后的出血轉化率[29]。缺血性腦卒中急性期血液中高水平的MMP-9會增加繼發(fā)性出血的風險[19]，血液MMP-9水平升高是出血轉化的預測標志物之一[26]。腦卒中患者MMP-9水平升高與出血轉化嚴重程度相關[34]。ROSELL等[14]對出血性卒中患者進行外周血檢測提示MMP-9水平很高，同時發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者腦組織中MMP-9主要分布在血管周圍組織，內皮細胞和穿過血管壁的外周中性粒細胞都是MMP-9陽性的，表明MMP-9的表達與血腦屏障滲漏有非常密切的關系，基底膜的破壞是腦缺血后微血管出血的主要原因。SUOFU等[34]發(fā)現(xiàn)MMP-9敲除不僅能縮小梗死體積、改善神經功能，而且能減少早期缺血再灌注誘導的腦出血發(fā)生率和出血轉化體積，對出血轉化表現(xiàn)為保護作用。

4 MMP-9的表達與缺血再灌注損傷及再灌注治療

NAN等[38]認為，缺血再灌注過程會誘導內質網應激參與NFкB-MMP-9級聯(lián)反應激活和MMP-9分泌增加。與之相矛盾的是，DOUGLAS等[21]通過動物實驗比較研究缺血再灌注程度對于MMP-9的表達水平的影響，發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達水平：未再灌注組織>部分再灌注組織>完全再灌組織，并認為MMP-9表達的早期增加對于缺血腦組織而言是作為一種可能的神經保護治療策略。r-TPA的溶栓血管再通治療被證明會導致MMP-9增高，這可能與纖溶酶參與將proMMP-9轉化為其活性形式的級聯(lián)反應有關[21]。CARBONE等[28]實施的一項病例對照研究，納入60例溶栓、30例未溶栓患者，在入院時、入院后1、7、90 d進行臨床檢查和采血，結果發(fā)現(xiàn)溶栓后1 h內血清MMP-9水平和前MMP-9的活性較未溶栓的患者在同一時間點顯著升高(P<0.0 5)。在腦卒中發(fā)病后7、90 d，接受溶栓治療患者基線血清MMP-9水平和前MMP-9活性仍顯著高于未接受溶栓治療患者，這表明r-TPA溶栓治療可能在較長時間增加血清MMP-9水平。目前，時間窗內接受血管內介入治療對患者體內MMP-9表達影響的相關研究甚少，值得進一步探究。

5 以MMP-9為靶點治療急性腦梗死

腦缺血后炎癥被認為在卒中患者中存在2種相反的功能，一個是有益的，另一個是有害的。缺血后炎癥會促進腦腫脹，導致缺血核心周圍的正常腦組織受壓，從而加劇神經缺陷。然而，缺血后炎癥也被認為可以促進缺血腦卒中恢復期的組織修復[39]。如前所述，MMPs在卒中急性期有不利影響，而在卒中后期卻存在有利作用，因為在組織重構和愈合過程中，內皮細胞、神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞產生的生長因子和基質金屬蛋白酶是驅動組織重組和修復的關鍵分子[37]，MMPs還參與了神經元前體細胞向卒中損傷區(qū)域的遷移[3]。在梗死周圍組織尚未壞死時，此區(qū)域已經出現(xiàn)MMP-9高表達，這提示MMP-9參與持續(xù)損傷過程[14]。在腦卒中晚期階段抑制炎性反應并不總是有益的，因為它們參與組織修復過程。但是在卒中急性期，這種腦缺血后炎癥的不良影響應該在可能的情況下通過醫(yī)學干預加以抑制。天然MMPs抑制劑產物包括四環(huán)素、白藜蘆醇、放線菌素等可通過螯合活性中心鋅離子抑制其活性[40]。米諾環(huán)素是一種非特異性的炎癥抑制劑，主要針對小膠質細胞，存在多個靶點，MMPs為其中之一。應用這種廣譜抗炎物質能減少缺血腦組織炎癥細胞浸潤、加強血腦屏障完整性和神經功能恢復[41]。KIM等[19]發(fā)現(xiàn)，肌肽通過螯合鋅對 MMP-9活性有抑制作用，減少腦缺血介導的血腦屏障緊密連接蛋白的降解，從而減少梗死體積和腦水腫。YASUNORI等[25]發(fā)現(xiàn)，通過在腦梗死急性期靜脈注射人羊膜間充質干細胞，以免疫調節(jié)的方式減少MMP-9的表達與活性，劑量依賴性地抑制血腦屏障破壞和細胞凋亡改善神經功能障礙。研究提示MMPs激活與腦缺血氧化應激和細胞凋亡有關，缺血性損傷后的神經元凋亡被認為是細胞死亡的一種機制，而使用基質金屬蛋白酶抑制劑治療可以阻止短暫局灶性腦缺血的細胞死亡[36]。

目前，多項動物實驗證實基質金屬蛋白酶抑制劑可以在腦梗死急性期病理過程中起保護作用，因此是很有希望的治療靶點，下一步開發(fā)高特異性的MMP-9抑制劑及進行相關動物與臨床試驗將可能為急性腦梗死的治療提供新的策略。