汪鴿，韓延華

（黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性40 歲之前，由于卵巢功能減退引起的一系列異常表現(xiàn)的臨床綜合征，主要特征為月經(jīng)紊亂，包括月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)（4 個月以上），同時伴有促性腺激素升高，連續(xù)2 次FSH 水平＞25 U/L（間隔4 周），以及波動性雌激素降低［1］。POI 患者可能會伴隨出現(xiàn)血脂異常、血壓波動、骨質(zhì)疏松、心血管疾病及不孕癥等，現(xiàn)已成為全球備受關注的問題。既往研究表明，本病發(fā)病率約為1%，30 歲前女性發(fā)病率為1‰［2］，并呈現(xiàn)逐年上升趨勢。中醫(yī)藥在對本病的治療有較好的臨床療效，因此探討顆粒細胞凋亡在POI 發(fā)生、發(fā)展中的機制，以及中醫(yī)藥對POI 的干預作用，具有重要意義。

1 細胞凋亡

細胞凋亡是指在一定的生理或病理條件下，細胞接受機體刺激信號后出現(xiàn)的一種主動的、受凋亡相關基因控制的細胞程序性死亡［3］。這是多細胞生物整個生命過程中不可缺少的環(huán)節(jié)，對器官組織的生長發(fā)育、免疫以及非正常細胞的清除具有重要意義［4］。細胞凋亡有嚴格的調(diào)控機制，以維系各組織器官的發(fā)育和穩(wěn)定，是多細胞生物中一種高度保守的機制，一般由特定因子觸發(fā)引起，表現(xiàn)出細胞皺縮，隨后出現(xiàn)密集的染色質(zhì)凝結、核碎片、細胞質(zhì)微泡，最終細胞分裂成凋亡小體，被鄰近的細胞或巨噬細胞迅速吞噬和消化［5］。當細胞凋亡機制出現(xiàn)異常時，會引起細胞過度增殖或過度凋亡，從而導致相關疾病的發(fā)生［6］。參與凋亡調(diào)控和執(zhí)行的途徑及基因產(chǎn)物可能是疾病過程中診斷和治療干預的優(yōu)秀靶點。因此，探討POI 的細胞凋亡機制對其防治有重要作用。

2 卵巢顆粒細胞凋亡誘導POI的內(nèi)在機制

卵泡發(fā)育的各個階段均有細胞凋亡的發(fā)生和參與，其在卵巢疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了關鍵作用。卵泡主要由卵母細胞、顆粒細胞和膜細胞組成，其中顆粒細胞是卵巢的基礎功能單位，位于卵母細胞透明帶外側，支持卵母細胞生長、發(fā)育和成熟，卵母細胞指導顆粒細胞的增殖、分化，參與了卵泡發(fā)育、成熟及排卵的整個過程。顆粒細胞在閉鎖卵泡中的凋亡早于卵母細胞，是卵泡閉鎖的發(fā)起者［7］。作為卵巢正常生理功能的重要部分，卵泡閉鎖可以清除不正常的組織，然而，一旦顆粒細胞凋亡機制失調(diào)，在卵母細胞未成熟的情況下引起大量卵泡閉鎖，且閉鎖速度快于生理代謝速度時，會過早耗盡卵巢儲備［8-9］，進而造成POI。在動物實驗中，有學者將卵泡的數(shù)目減少、閉鎖增多，間質(zhì)增生，散在慢性炎細胞浸潤，卵巢組織萎縮作為卵巢早衰大鼠造模成功依據(jù)，而這些大鼠竇前及竇狀囊泡數(shù)減少，顆粒細胞層明顯減少處于凋亡狀態(tài)［10］。電泳實驗顯示，在閉鎖卵泡的顆粒細胞中分離出的DNA 片段呈梯帶圖案，這也是細胞凋亡的特征性標志［11］。HUANG 等［12］發(fā)現(xiàn)卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細胞層紊亂，而干預后能夠逆轉(zhuǎn)這些指標，并糾正凋亡相關蛋白表達，由此可見顆粒細胞的異常在POI 的發(fā)展中起著關鍵性作用。而顆粒細胞凋亡也是程序性死亡，由不同的凋亡調(diào)控分子活化Caspase 級聯(lián)，導致凋亡的發(fā)生。

目前主要有3 條途徑介導顆粒細胞凋亡的發(fā)生，分別是死亡受體介導途徑、線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。

2.1 死亡受體介導途徑

死亡受體信號轉(zhuǎn)導途徑是介導凋亡發(fā)生的重要途徑之一，又被稱為外源性凋亡途徑，是指細胞外信號所誘導的凋亡途徑，該受體也是腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族中的一員。細胞外有富含半胱氨酸的區(qū)域，與其配體相結合共同誘導凋亡；細胞內(nèi)有一名為死亡區(qū)域（deathdomain，DD）的結構［13-14］，擁有蛋白水解功能。DD 首先啟動死亡信號，并進行傳導，最終引發(fā)細胞凋亡［15］。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的眾多死亡受體中，具有介導凋亡信號傳導功能的主要有3條：Fas/FasL、TNFR和TRAIL。

Fas/FasL 途徑：Fas 是細胞表面重要的死亡受體，是跨膜糖蛋白，其配體為FasL，F(xiàn)as 受到刺激后與其配體相結合，導致3 個Fas 受體分子聚集形成三聚體，使Fas 相關死亡結構域蛋白（FADD）構象發(fā)生了變化，激活FADD［16］。FADD 的N 端是死亡效應域（DED），C 末端是DD，DED 與pro-Caspases-8 的DED 相連接［17］，形成了一個重要的誘導凋亡的平臺——死亡誘導信號復合體（DISC），激活下游的效應因子Caspase 水解靶蛋白，最終導致細胞凋亡［18］。

TNFR 途徑：TNF 主要通過TNFR1 和TNFR2 兩種受體介導其發(fā)揮生物學效應。TNFR1 表達于幾乎所有細胞類型中，其胞內(nèi)區(qū)含有DD，可以引起細胞凋亡，而TNFR2的胞質(zhì)區(qū)不含DD，故無法引起凋亡［19］。TNF通過DD 與TNFR1 結合后，募集銜接蛋白FADD 和TRADD，TRADD、FADD 與pro-Caspase-8 形成DISC，激活pro-Caspase-8，進而激活下游Caspase 活性誘導凋亡的發(fā)生［16］。而TNFR2則會通過NF-κB 誘導抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄［20］。因此TNFR 可能誘導凋亡及抗凋亡兩種不同的信號途徑，最終結果如何，取決于雙方信號水平的強弱及時機的不同［21］。

TRAIL 途徑：TRAIL 有兩個死亡受體——DR4/5，又稱功能型受體，他們的結構類似，其細胞內(nèi)有傳遞凋亡信號的DD。TRAIL 可以通過與DR4/5 結合的方式來傳遞凋亡信號。TRAIL 與表達在細胞膜表面的DRs結合后活化成三聚體，募集FADD［22］。隨后FADD通過DED 之間的相互作用結合凋亡起始因子pro-Caspase-8，形成DISC［23］，激活為Caspase-8并通過兩種途徑來傳遞死亡信號。一種是外源性凋亡途徑，Caspase-8 活化后，可以直接激活下游Caspase 級聯(lián)反應，啟動凋亡執(zhí)行蛋白酶Caspase-3 促使細胞凋亡。另一種是內(nèi)源性凋亡途徑，需要依賴線粒體來完成凋亡誘導過程，又稱線粒體依賴型通路，活化的Caspase-8 切割Bid 為tBid 形式，轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)，作用于線粒體膜上，使其通透性增加，釋放細胞色素C（Cyt C）和一些凋亡誘導因子到胞漿中，誘導細胞凋亡發(fā)生［24］。

綜上，F(xiàn)as/FasL、TNFR和TRAIL 3條途徑共同交匯于Caspase-8激活下游因子而發(fā)生凋亡。但目前對死亡受體的相關研究尚未成熟，很多內(nèi)在的機制仍不完善，未來需要對受體信號調(diào)節(jié)做進一步研究。

2.2 線粒體途徑

卵泡的成功發(fā)育取決于多種因素，包括受體和激素之間的協(xié)調(diào)表達、細胞因子刺激、最佳pH 值和充足的能量供應。而線粒體是細胞能量的主要提供者，在細胞凋亡過程中起著重要作用，它可以調(diào)節(jié)細胞代謝、細胞周期和細胞信號轉(zhuǎn)導［25］。

當機體處于氧化應激狀態(tài)時，線粒體膜通透性增加，并增加活性氧（ROS）的數(shù)量，線粒體功能障礙和氧化應激共同誘導顆粒細胞凋亡［26］。進而使得卵泡發(fā)育異常，發(fā)生閉鎖，進一步發(fā)展引起POI。此外作為參與線粒體動力學的最重要蛋白質(zhì)之一，線粒體融合基因2（mitofusin2，Mfn2）在調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)和維持線粒體DNA 穩(wěn)定性方面起著不可或缺的作用。它是一種位于線粒體外膜的保守的Dynamin 樣GTP 酶，通過調(diào)節(jié)其融合和裂變過程來影響線粒體的結構和功能［27-28］。Mfn2 通過調(diào)節(jié)其呼吸鏈，線粒體膜電位以及細胞代謝和細胞凋亡來維持正常的哺乳動物細胞功能［29-30］，因此Mfn2 的較低表達會增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力，這可能導致顆粒細胞凋亡［31-32］。Mfn2 在維持線粒體DNA 的完整性中起重要作用，其可能通過線粒體氧化磷酸化影響顆粒細胞的功能。有研究結果顯示小鼠組織中Mfn2水平的降低會引起線粒體形態(tài)的改變，推測Mfn2 可能使濾泡發(fā)育紊亂，從而通過調(diào)節(jié)線粒體功能和能量代謝，導致POI［33］。研究顯示卵巢早衰患者線粒體DNA含量比正常人的低［34］。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞中重要的膜性細胞器，它可以對蛋白質(zhì)進行處理，同時通過對鈣的貯存與釋放參與細胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。當細胞發(fā)生鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應激、蛋白質(zhì)糖基化修飾過強、感染、炎癥等刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白增多或鈣離子濃度發(fā)生變化，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［35］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）是細胞的一種自我保護性措施，能加強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理蛋白質(zhì)的能力，恢復其穩(wěn)定狀態(tài)，從而促進細胞的存活［36］。當ERS 過于強烈和持久，UPR 不能抵抗，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)不能恢復時，則發(fā)生細胞凋亡。其激活細胞凋亡主要表現(xiàn)在兩個方面。首先，ERS 主要通過活化CHOP 和JNK 兩個重要的中間信號分子傳導，最終由Caspase-12執(zhí)行細胞凋亡命令［37］。其次，細胞通過感應胞漿內(nèi)高濃度的Ca2+激活鈣依賴性蛋白酶，進而誘導凋亡，同時，高濃度Ca2+又可以作用于線粒體使其膜電位改變，釋放Cyt C，與胞質(zhì)中人凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf1）結合，進一步激活Caspase-3 和Caspase-7，促進細胞凋亡［38］。

吳玉萍［39］通過建立順鉑誘導POI小鼠模型和體外順鉑刺激卵巢顆粒細胞實驗模型，結果顯示順鉑可激發(fā)顆粒細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，損傷卵巢結構，誘發(fā)顆粒細胞凋亡增多而導致POI 的發(fā)生，運用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑后，顆粒細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激得以緩解，顆粒細胞凋亡率降低，最終緩解POI的程度。

3 中醫(yī)藥調(diào)控顆粒細胞凋亡治療POI

隨著POI 研究的進一步深入，中醫(yī)藥調(diào)節(jié)卵巢功能，延緩POI 的內(nèi)在機制受到越來越多臨床工作者的關注，針對單味中藥提取物、中藥復方及中醫(yī)其他治法對卵巢顆粒細胞凋亡的調(diào)控作用開展了諸多研究，且療效良好。

3.1 中藥單體提取物

李育等［40］觀察山茱萸多糖對自然衰老雌性小鼠卵巢功能的改變，發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖組與空白對照組相比在電鏡下可見到各級生長卵泡，顆粒細胞多而厚，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，證實山茱萸多糖具有抗衰老作用，能夠明顯改善自然衰老雌性小鼠的卵巢功能。馬蔚蓉等［41］采用雷公藤苷灌胃制備POI 小鼠，發(fā)現(xiàn)模型小鼠血清抗氧化物SOD、CAT 水平降低，顆粒細胞中的Nrf-2、HO-1 表達降低，ROS 水平上升，提示存在氧化應激。予金絲桃苷治療后，POI 小鼠卵泡數(shù)和黃體數(shù)均增加，卵巢病理損傷減輕，血清FSH 水平降低，E2、AMH、SOD、CAT 水平升高，卵巢顆粒細胞中的氧化相關指標（Nrf-2、HO-1）和凋亡相關指標（p-PI3K、p-Akt、Bcl-2）表達上升，氧化相關因子ROS 水平降低，凋亡相關因子Caspase-3 和Bax 表達下降，TUNEL顯示細胞凋亡水平降低。提示金絲桃苷具有抗氧化、抗凋亡作用，并通過相關因子來減少POI 小鼠卵巢顆粒細胞凋亡，增加了各級卵泡數(shù)，一定程度上修復了卵巢病理損傷，改善了卵巢儲備。

3.2 中藥復方

王玲［42］通過對經(jīng)方左歸丸的研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸可以通過抑制AZAb 的產(chǎn)生和抑制Fas 介導的卵泡細胞凋亡使自身免疫性POF 模型小鼠的Bcl-2 增加，F(xiàn)aL降低，細胞凋亡率明顯下降，從而改善小鼠卵巢及免疫功能。劉慧萍等［43］研究顯示，補腎活血方組（熟地黃、山茱萸、紫石英、補骨脂、菟絲子、生地黃、桑寄生、烏藥、雞內(nèi)金、澤瀉、土鱉蟲、覆盆子、路路通、澤蘭、桔梗、水蛭和甘草）小鼠Fas mRNA 表達水平明顯低于模型組。補腎活血方通過抑制Fas、FasL 基因的表達和提高E2，降低LH、FSH 的水平，從而改善卵泡顆粒細胞的凋亡達到治療作用。張麗娟等［44］研究了二仙湯對順鉑所致模型組小鼠的影響，灌胃后二仙湯組BXA 蛋白表達量減少，Bcl-2蛋白表達增加，凋亡的卵泡顆粒細胞減少，E2含量升高，說明二仙湯可通過抑制順鉑減輕卵巢顆粒細胞凋亡，改變E2與FSH 含量，促進卵泡生長，促進卵巢功能的恢復。譚貝加等［45］研究發(fā)現(xiàn)，寧心紅杞膠囊能夠增加卵泡顆粒細胞中線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量，并改善其形態(tài)，改善顆粒細胞功能，延緩卵巢衰老。

3.3 中醫(yī)其他療法

盧巖等［46］運用盧氏隔藥灸臍法治療POI 大鼠，大鼠卵巢Bcl-2 蛋白和mRNA 表達顯著升高，Bax 蛋白和mRNA 表達明顯降低，提示隔藥灸臍可以通過抑制卵泡顆粒細胞的凋亡來改善卵巢功能。曹俊紅針刺大鼠腎俞、足三里和三陰交穴治療圍絕經(jīng)期大鼠，與未接受針刺的大鼠對比發(fā)現(xiàn)，針刺治療后大鼠卵巢顆粒細胞Fas mRNA 表達明顯降低，而Bcl-2 mRNA 表達明顯提高［47］。鄭艷華等［48］發(fā)現(xiàn)低頻電針能夠降低大鼠卵巢組織中Bax/Bcl-2 比值，卵巢染色切片發(fā)現(xiàn)接受針刺的大鼠卵巢可見多個黃體存在，囊性卵泡減少，顆粒細胞層明顯增厚，推測針灸可能是通過線粒體途徑和死亡受體途徑抑制卵巢細胞凋亡，改善卵巢微環(huán)境，從而延緩卵巢早衰的進程。

綜上可見，中醫(yī)藥對POI 的治療均以補腎為基本原則，腎藏精，主生殖，為先天之本，元氣之根，腎氣盛則天癸至，月事來潮，腎為卵巢功能盛衰、月經(jīng)行止、卵泡發(fā)育的主導，故選用補腎填精之中藥和腧穴。研究中亦發(fā)現(xiàn)，補腎能提高免疫功能，增加卵巢血流，改善卵巢微環(huán)境，提升卵巢功能，促進卵泡發(fā)育。故補腎益精是促卵泡發(fā)育，治療POI的根本大法。

4 展望

近年來對POI機制的研究不斷深入，已經(jīng)證實POI與凋亡、自噬、氧化應激等機制相關，目前激素替代療法（HRT）是經(jīng)典的治療方案，但激素治療會增加乳腺癌、血栓性疾病和肝腎代謝異常等風險。越來越多實驗研究證明中醫(yī)藥在改善卵巢功能方面有著較好的效果，體現(xiàn)了中醫(yī)藥多途徑、多靶點的作用特點［49］。本文介紹了介導卵巢顆粒細胞凋亡導致POI 的3 種途徑及中醫(yī)藥通過抑制凋亡分子降低顆粒細胞凋亡率，改善卵巢功能的作用，可以為POI 的防治提供思路。補腎貫穿治療本病之始終，符合現(xiàn)代中醫(yī)婦科通過調(diào)整腎-天癸-沖任-胞宮生殖軸的理論思想，能夠改善卵巢功能，提高卵子質(zhì)量，促進卵泡發(fā)育成熟，為臨床治療POI提供了更多的可能性。但目前研究領域主要停留在細胞因子的相關研究上，加大中醫(yī)藥與凋亡機制的研究，將是未來研究的重點和方向［50］，這對治療POI、改善相關癥狀、提高生育率都有十分重要的意義。