◎ 薛 遠(yuǎn)，宋春麗，任 健

（齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

食品蛋白質(zhì)的糖基化修飾，是將親水性的糖類物質(zhì)以共價(jià)鍵連接的方式連接到蛋白質(zhì)分子之中，使其既具有蛋白質(zhì)的大分子特性，又具有糖類物質(zhì)的親水特性[1]。美拉德反應(yīng)是在食品領(lǐng)域中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性時(shí)常用的技術(shù)手段。美拉德反應(yīng)是蛋白質(zhì)的游離氨基與還原糖的羰基共價(jià)交聯(lián)，產(chǎn)生糖基化蛋白質(zhì)的過程[2]。本文對(duì)美拉德反應(yīng)對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)、功能性質(zhì)的影響以及目前美拉德產(chǎn)物構(gòu)效關(guān)系研究存在的局限性進(jìn)行綜述，同時(shí)展望了該研究在食品加工中的應(yīng)用前景。

1 美拉德反應(yīng)機(jī)理

美拉德反應(yīng)是食品加工中普遍存在的、涉及碳水化合物和蛋白質(zhì)的一類非褐變反應(yīng)，最初是由法國化學(xué)家Louis-Camille Maillard發(fā)現(xiàn)。該反應(yīng)是蛋白質(zhì)、肽或氨基酸的氨基與還原糖的羰基發(fā)生了縮合、降解、裂解等反應(yīng)，席夫堿形成并重排為Amadori或Heyns產(chǎn)物，最后形成了大分子化合物類黑素，導(dǎo)致褐變[3]。糖基化反應(yīng)過程主要由3個(gè)階段（早期、中期、晚期）構(gòu)成，采用糖分子對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性主要是基于美拉德反應(yīng)早期的第一步，即還原糖的羰基和蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，生成糖基化蛋白質(zhì)。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量與種類主要受反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH以及氨基與糖基比等條件的影響，導(dǎo)致產(chǎn)物的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能性不同。

目前，美拉德反應(yīng)分為干熱法和濕熱法。干熱法是最早制備蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物的方法之一，且具有無額外反應(yīng)底物、易控制反應(yīng)條件和高接枝度的優(yōu)點(diǎn)。干熱法是先將蛋白質(zhì)與糖分子混合溶液凍干，針對(duì)固體反應(yīng)底物，在一定相對(duì)濕度和反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行高溫加熱，制備糖基化蛋白質(zhì)。利用大豆蛋白與麥芽糊精作為底物，在90 ℃下進(jìn)行干熱糖基化反應(yīng)，制備大豆蛋白-麥芽糊精共聚物，結(jié)果表明干法美拉德反應(yīng)能夠提高大豆蛋白的溶解性和乳化性等相關(guān)性質(zhì)[4]。

濕熱法是最基礎(chǔ)的糖基化加工方法，濕熱法是蛋白質(zhì)與糖分子的混合溶液在高溫下發(fā)生糖基化反應(yīng)，凍干得到糖基化產(chǎn)物。濕熱法美拉德有利于蛋白質(zhì)和糖分子之間的接觸發(fā)生反應(yīng)，提高該反應(yīng)的接枝度，從而對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)產(chǎn)生影響。利用大豆蛋白與杏鮑菇多糖在90 ℃條件下反應(yīng)1 h，進(jìn)行濕熱法美拉德反應(yīng)，制備大豆蛋白-杏鮑菇多糖共聚物，結(jié)果表明糖基化后的大豆蛋白具有更好的溶解性和乳化性，能夠制備高穩(wěn)定性的大豆蛋白-杏鮑菇多糖共聚物穩(wěn)定乳劑[5]。

2 美拉德反應(yīng)對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響

美拉德反應(yīng)使大豆蛋白與還原糖發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，能夠改變大豆蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)產(chǎn)生影響。

2.1 微觀結(jié)構(gòu)

目前，測(cè)定蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的方法主要有掃描電子顯 微 鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）、透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）和激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）。以大豆蛋白與麥芽糖為原料，進(jìn)行美拉德糖基化反應(yīng)制備糖基化產(chǎn)物，利用SEM檢測(cè)證實(shí)，糖基化產(chǎn)物的顆粒與大豆蛋白相比更加疏松、均勻且分子聚集性顯著降低[6]。采用大豆蛋白與大豆多糖制備多糖蛋白復(fù)合性乳液，利用TEM，發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳液的乳液液滴分布均勻、顆粒大小均一，結(jié)果證明多糖增加了大豆蛋白的乳液穩(wěn)定性[7]。利用CLSM分析乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)，證明大豆肽-葡聚糖共聚物可以在油滴表面形成一個(gè)很厚的吸附層，提高油滴的抗破乳能力，增加乳液的穩(wěn)定性[8-10]。

2.2 一級(jí)結(jié)構(gòu)

傅里葉紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectoscopy，F(xiàn)T-IR）能夠反應(yīng)糖基化蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，主要體現(xiàn)在C-N和N-H鍵吸收峰彎曲振動(dòng)。FT-IR研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白-果糖共聚物在1 600～1 500 cm-1處的酰胺I特征峰和在1 500～1 400 cm-1酰胺Ⅱ特征峰波動(dòng)減弱[12]；大豆蛋白-葡聚糖共聚物在1 410 cm-1區(qū)域的酰胺Ⅲ特征峰振動(dòng)增強(qiáng)，相應(yīng)的，C-O伸展和O-H彎曲也發(fā)生了變化，即在2 931 cm-1和3 290 cm-1處發(fā)生了C-H伸縮振動(dòng)與N-H的伸縮振動(dòng)，證實(shí)美拉德反應(yīng)對(duì)大豆蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[13]。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)

糖基化導(dǎo)致食品蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要形式包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲數(shù)量的變化，這決定了蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能。二級(jí)結(jié)構(gòu)可以通過圓二色譜（Circular Dichroism，CD）和FT-IR來檢測(cè)。利用CD分析證實(shí)，大豆蛋白-麥芽糖共聚物與大豆蛋白相比，α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量降低，無規(guī)則卷曲含量顯著增加，美拉德反應(yīng)對(duì)大豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有顯著影響[11]。采用葡萄糖、乳糖與11S大豆球蛋白分別進(jìn)行美拉德反應(yīng)后，利用FT-IR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)11S大豆球蛋白-葡萄糖共聚物和11S大豆球蛋白-乳糖共聚物的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角的含量都顯著減小，但無規(guī)則卷曲的含量顯著增加，證實(shí)美拉德反應(yīng)對(duì)11S大豆球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)影響顯著[12]。

2.4 三級(jí)結(jié)構(gòu)

一般來說，利用熒光光譜分析色氨酸光譜，能夠觀察蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。利用內(nèi)源熒光光譜發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白-果糖共聚物的熒光強(qiáng)度降低，最大激發(fā)波長(zhǎng)（λmax）增加，證實(shí)美拉德反應(yīng)改變了大豆蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[13]。利用外源熒光光譜進(jìn)行分析，大豆蛋白水解物-葡聚糖共聚物的最大熒光強(qiáng)度發(fā)生了紅移現(xiàn)象，色氨酸的周圍環(huán)境極性增強(qiáng)，且熒光強(qiáng)度降低，這一結(jié)果證實(shí)美拉德反應(yīng)使葡聚糖取代大豆蛋白表面的分子，對(duì)大豆蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響[14]。

3 美拉德糖基化產(chǎn)物功能性質(zhì)的變化

3.1 溶解性

溶解性是指大豆蛋白在水溶液中的溶解能力。大豆蛋白的溶解性在食品加工中起到了重要作用，美拉德反應(yīng)使大豆蛋白的親水性羥基增多，改善蛋白質(zhì)的溶解性，從而擴(kuò)大大豆蛋白的應(yīng)用范圍。干熱法制備的大豆蛋白-葡萄糖共聚物的溶解性顯著高于大豆蛋白，而且也顯著高于超聲法改性大豆蛋白，表明美拉德反應(yīng)比超聲法更有利于提高大豆蛋白的 溶解性[15]。

反應(yīng)時(shí)間會(huì)影響大豆蛋白的溶解性。美拉德反應(yīng)初期，大豆蛋白中引入大量親水性糖分子，親水性羥基含量增加，溶解性增高。然而，反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)有一部分蛋白質(zhì)因分子量增大發(fā)生聚集沉降，導(dǎo)致溶解度下降。同時(shí)，美拉德反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)進(jìn)入到晚期階段，生成類黑素等大分子物質(zhì)，最終蛋白質(zhì)的溶解性降低。在90 ℃水浴條件下，將大豆蛋白與乳糖按質(zhì)量比4∶1進(jìn)行美拉德反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，加熱時(shí)間分別為1～5 h，制備得到大豆蛋白-乳糖共聚物。結(jié)果證實(shí)，隨反應(yīng)時(shí)間增加，大豆蛋白的溶解性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到3 h后，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，溶解性逐 漸下降[16]。

糖的種類也會(huì)影響大豆蛋白的溶解性。在80 ℃條件下，按1∶4的質(zhì)量比分別將葡萄糖、麥芽糖與大豆蛋白相混合，制備糖基化產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)隨反應(yīng)時(shí)間增加兩種糖基化大豆蛋白的溶解性逐漸升高，且高于大豆蛋白。此外，大豆蛋白-麥芽糖共聚物的溶解性總是高于大豆蛋白-葡萄糖共聚物。反應(yīng)時(shí)間高于6 h后，兩種產(chǎn)物的溶解性下降，其中大豆蛋白-葡萄糖共聚物的溶解性要低于大豆蛋白。葡萄糖分子較小，與麥芽糖相比更容易與大豆蛋白發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生類黑素等，反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)降低大豆蛋白的溶解性[17]。

3.2 乳化性質(zhì)

乳化性是大豆蛋白乳濁液形成能力與穩(wěn)定性的重要影響因素，而大豆蛋白的乳化性是由其本身的結(jié)構(gòu)與溶解性決定的。美拉德反應(yīng)可以使大豆蛋白的親水性增強(qiáng)，更有利于有效吸附在油-水界面上，通過降低表面張力來提高蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性。通過改變大豆蛋白與阿拉伯膠的原料質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間制備出乳化性顯著提高的大豆蛋白。研究證實(shí)在質(zhì)量比1∶2（阿拉伯膠∶大豆蛋白）、反應(yīng)溫度60 ℃條件下反應(yīng)16 h，大豆蛋白的乳化性顯著提高51.2 m2·g-1[14]。

美拉德反應(yīng)時(shí)間增加會(huì)改變大豆蛋白的結(jié)構(gòu)，對(duì)乳化性及乳化穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。美拉德反應(yīng)初期，蛋白質(zhì)的游離氨基逐漸暴露在蛋白質(zhì)分子表面，隨反應(yīng)時(shí)間增加生成更多的糖基化產(chǎn)物，親水性羥基增加，達(dá)到親水和親油的平衡，乳化性增強(qiáng)；美拉德反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，反應(yīng)體系中游離氨基和殼寡糖的羰基逐漸減少，蛋白質(zhì)發(fā)生自交聯(lián)，溶解性逐漸下降，乳化性降低。此外，糖基化產(chǎn)物增加，會(huì)使吸附在油-水界面處油滴上的保護(hù)層厚度有所增大，油滴不易發(fā)生聚集現(xiàn)象，乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)。以葡萄糖和大豆蛋白原料，在質(zhì)量比4∶1、反應(yīng)溫度70～90 ℃條件下反應(yīng)0～6 h， 得到反應(yīng)時(shí)間和溫度不同的大豆蛋白-葡萄糖共聚物。結(jié)果證實(shí)，隨反應(yīng)時(shí)間增加，反應(yīng)體系的顏色不斷加深，且乳化性及乳化穩(wěn)定性顯著提高；在反應(yīng) 6 h時(shí)，大豆蛋白乳化性提高最為顯著，從0.168提高到了0.574。在反應(yīng)4 h時(shí)，乳化穩(wěn)定性提高最為顯著，從17.37%提高到38.7%[18]。在不同反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度條件下制備大豆蛋白-殼寡糖共聚物，以乳化性為響應(yīng)面，探究制備高乳化性的大豆蛋白-殼寡糖共聚物的最佳反應(yīng)條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白-殼寡糖共聚物的乳化性以及乳化穩(wěn)定性隨反應(yīng)時(shí)間的增加出現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，且在反應(yīng)時(shí)間為9 h時(shí)達(dá)到最高值[19]。

美拉德反應(yīng)溫度也會(huì)對(duì)乳化性及乳化穩(wěn)定性產(chǎn)生影響?？刂泼览路磻?yīng)溫度可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到伸展，提高蛋白質(zhì)的分子表面活性，減少空間位阻，有利于蛋白質(zhì)與糖分子發(fā)生反應(yīng)，生成大量糖基化產(chǎn)物，提高大豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性。但是溫度過高時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性，分子的表面活性降低，阻礙兩者的結(jié)合，從而減少糖基化產(chǎn)物產(chǎn)生，使乳化性及乳化穩(wěn)定性下降。以大豆蛋白和殼寡糖為原料，采用不同溫度條件下反應(yīng)9 h制備大豆蛋白-殼寡糖共聚物。結(jié)果證實(shí)，反應(yīng)溫度對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性產(chǎn)生影響不同，在40 ℃時(shí)大豆蛋白-殼寡糖共聚物的乳化性以及乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值[19]。

3.3 流變性

流變性測(cè)定包括蛋白質(zhì)的表觀黏度以及黏彈性能。食品蛋白質(zhì)的黏彈性不同，會(huì)賦予食品不同的質(zhì)感。在超聲和未超聲條件下制備大豆蛋白-香菇多糖共聚物，證實(shí)大豆蛋白-香菇多糖共聚物在未超聲條件下，表觀黏度顯著提高（13.89%），超聲40 min后表觀黏度（26.48%）是傳統(tǒng)方式1.91倍。美拉德反應(yīng)能夠提高大豆蛋白的表觀黏度，且與超聲法結(jié)合后大豆蛋白的表觀黏度改善更加明顯[20]。將大豆蛋白與葡萄糖按質(zhì)量比1∶2混合，在95 ℃條件下反應(yīng)4 h，得到大豆蛋白-葡萄糖共聚物，通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶法制備凝膠，對(duì)凝膠模擬體外胃腸道消化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)消化產(chǎn)物的黏度、彈性模量（G′）、黏性模量（G″）顯著升高[21]。

4 大豆蛋白及其糖基化產(chǎn)物在食品加工中的應(yīng)用

大豆蛋白因?yàn)槠淞己玫臓I(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及多種功能特性而被廣泛應(yīng)用于肉制品、焙烤食品、飲料、乳品、食品涂層和糖果等食品工業(yè)領(lǐng)域。

4.1 在肉制品中的應(yīng)用

大豆蛋白及其糖基化產(chǎn)物在肉制品中能夠改善肉制品的風(fēng)味、阻止肉汁分離和提高肉類制品的品質(zhì)等。在豬肉制品中加入大豆蛋白后，不僅能提高肉制品的硬度，增強(qiáng)了咀嚼口感，而且還能彌補(bǔ)肉制品高熱量、高膽固醇等缺點(diǎn)[22]。將大豆蛋白糖基化產(chǎn)物與肌原纖維蛋白混合制成凝膠，證實(shí)添加大豆蛋白的肌原纖維凝膠比原肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)更加致密均勻，且提升了肌原蛋白凝膠的彈性和硬度[23]。

4.2 在烘焙制品中的應(yīng)用

大豆蛋白及其糖基化產(chǎn)物在烘焙制品中能夠改善食品的色澤，提升口感和風(fēng)味，還可以保持游離水，有效延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。通過美拉德反應(yīng)制備大豆蛋白-低聚木糖共聚物，證實(shí)該共聚物添加在重油蛋糕中，能有效延長(zhǎng)重油蛋糕的貨架期，提高重油蛋糕的適口性以及耐儲(chǔ)藏特性[24]。在面包的制作過程中加入糖基化大豆蛋白，面包的硬度降低，而且面包的彈性和回復(fù)性提高[25]。

4.3 在冰淇淋中的應(yīng)用

冰淇淋是受到人們喜歡的一種乳制品，但是有一部分人患有乳糖不耐癥，將大豆蛋白添加在冰淇淋中可以降低其乳糖含量，使消費(fèi)者有效避免乳糖不耐癥的不良反應(yīng)。以大豆蛋白和乳粉為原料，按一定比例制作冰淇淋，發(fā)現(xiàn)添加大豆蛋白使冰淇淋的融化率、黏度與硬度顯著提高，且無不好的豆腥味，感官評(píng)價(jià)的綜合指標(biāo)增加，適合應(yīng)用于冰淇淋生產(chǎn)[26]。將大豆蛋白和乳清蛋白按比例進(jìn)行配比制備出復(fù)配蛋白質(zhì)，分析發(fā)現(xiàn)復(fù)配蛋白冰淇淋的硬度較好、抗融化性以及膨脹率增強(qiáng)[27]。

5 糖基化產(chǎn)物構(gòu)效關(guān)系研究存在的局限性

研究證實(shí)美拉德反應(yīng)的糖基化可以改善大豆蛋白的許多重要功能性質(zhì)，在食品領(lǐng)域具有一定發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳?，基于美拉德途徑的蛋白質(zhì)糖基化修飾，通常采用兩種方式調(diào)控蛋白質(zhì)的糖基導(dǎo)入量：一種手段是控制糖基化反應(yīng)時(shí)間，但該法存在一定的局限性，如存在反應(yīng)過度產(chǎn)生類黑素等有害物質(zhì)的情況，而且將破壞蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)；另一種方式是通過改變導(dǎo)入糖基的分子量，如分別將單糖、寡糖、多糖導(dǎo)入到蛋白質(zhì)中，獲得具有不同糖基導(dǎo)入量的蛋白質(zhì)。值得注意的是，美拉德反應(yīng)在導(dǎo)入糖基的同時(shí)，還伴隨著蛋白質(zhì)的自交聯(lián)現(xiàn)象。因此，上述方法在剖析糖基導(dǎo)入量對(duì)美拉德產(chǎn)物功能性質(zhì)的影響規(guī)律時(shí)，很難界定蛋白質(zhì)自交聯(lián)帶來的潛在影響，所得結(jié)論缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性、科學(xué)性。

6 展望

闡明美拉德反應(yīng)中糖基變化對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的影響機(jī)制，對(duì)開發(fā)特定功能性食品配料具有重要意義。但是，目前美拉德糖基化研究在該方面具有一定局限性，急需在保證大豆蛋白自交聯(lián)程度不變的前提下，基于定向改變糖基化大豆蛋白側(cè)鏈糖基的方法，開展揭示美拉德途徑糖基化蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的相關(guān)研究，通過各個(gè)指標(biāo)的分析和評(píng)估研究，確定、剖析大豆蛋白糖基化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響模式和機(jī)制，為定向開發(fā)特定功能的大豆蛋白配料提供理論支撐，有利于擴(kuò)大大豆蛋白在食品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍。