李旻向 劉爾倫 周湘丹 曾光熙

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128）

菌種退化是指菌種在培養(yǎng)或保存的過程中，由于各種因素的影響而引起的某些優(yōu)良性狀劣化的現(xiàn)象，主要是由于自發(fā)突變的存在，使遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，引起有關(guān)基因的負(fù)突變，從而導(dǎo)致菌種某些優(yōu)良性狀丟失。菌種退化不是瞬間發(fā)生的，而是一個(gè)由量變到質(zhì)變的過程，主要發(fā)生在傳代培養(yǎng)過程中。即使突變發(fā)生頻率較低，數(shù)目基數(shù)龐大的菌群中也會出現(xiàn)少量發(fā)生突變的個(gè)體，并在后續(xù)傳代培養(yǎng)中突變菌株逐漸取代目的菌株成為優(yōu)勢菌種，影響群體中某產(chǎn)物產(chǎn)量。

1 菌種退化的原因

1.1 自發(fā)突變

目前認(rèn)為造成菌種退化的主要原因是自發(fā)突變。自發(fā)突變是指由于自然界中各種誘變劑的作用，或由于DNA在復(fù)制、修復(fù)等過程中堿基配對出現(xiàn)錯(cuò)誤而導(dǎo)致有關(guān)基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而產(chǎn)生的突變[1]。對于微生物來說，其自身一些特殊的生理特性決定了自發(fā)突變頻率較其他生物更高。例如：大腸桿菌的代時(shí)為20 min，這說明其在一定時(shí)間內(nèi)DNA復(fù)制次數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他真核生物細(xì)胞，使其在復(fù)制過程中出現(xiàn)錯(cuò)誤的概率增大，因而自發(fā)突變現(xiàn)象在微生物中的發(fā)生頻率更高。自然環(huán)境中存在大量誘變劑，包括某些化學(xué)物質(zhì)或者宇宙空間中的各種射線。在誘變劑的作用下，DNA結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，更容易發(fā)生突變。

化學(xué)物質(zhì)能誘導(dǎo)微生物自發(fā)突變，但不是由單一的某種化學(xué)物質(zhì)所導(dǎo)致，而是由多種不明的誘變劑綜合作用導(dǎo)致的，這些化學(xué)物質(zhì)通常對微生物有著長期的誘導(dǎo)作用，即便是低劑量，也會對微生物的自發(fā)突變產(chǎn)生難以忽視的影響。例如，活性氧簇（ROS）就是一種常見的化學(xué)誘變劑，它是一種內(nèi)源性地引起細(xì)胞DNA損傷和老化的物質(zhì)。ROS能導(dǎo)致幾種形態(tài)的DNA損傷，包括單鏈和雙鏈斷裂、化學(xué)加成、錯(cuò)誤交聯(lián)[2]。ROS中的過氧化氫作為一類細(xì)胞代謝產(chǎn)物，是由過氧化氫基團(tuán)水解產(chǎn)生的。過氧化氫基團(tuán)又被稱為“自由基”，是由生物體內(nèi)過氧化氫酶催化蛋白質(zhì)集團(tuán)生成過氧化氫能對微生物DNA產(chǎn)生損傷作用，當(dāng)損傷程度較高時(shí)，甚至?xí)?dǎo)致微生物死亡。

空間中存在的宇宙射線也是導(dǎo)致細(xì)胞自發(fā)突變的原因之一，宇宙射線的輻射作用造成DNA斷裂，從而導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性改變，進(jìn)而造成突變。其中，DNA雙鏈斷裂是影響細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)的主要DNA鏈斷裂類型，其是一種類型的DNA損傷，是真核生物中最有害的損傷，嚴(yán)重影響基因組完整性[3]，對微生物影響較大。同時(shí)，由于其在正常的修復(fù)機(jī)制下并不能得到修復(fù)，因而常常導(dǎo)致一系列問題，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

1.2 連續(xù)傳代

連續(xù)傳代能導(dǎo)致菌種退化，主要是由于在連續(xù)傳代的過程中，菌種發(fā)生自發(fā)突變的頻數(shù)會增加。傳代過程中發(fā)生自發(fā)突變的概率隨著傳代次數(shù)的增加而增加，尤其是負(fù)突變發(fā)生概率將大大增加。在連續(xù)繼代培養(yǎng)后，發(fā)酵菌株將經(jīng)歷退化過程，這與其生理等方面有重要關(guān)聯(lián)。例如，Bachmann等將一株乳酸乳球菌株連續(xù)傳代繁殖1000代，后續(xù)通過測序發(fā)現(xiàn)，3株傳代菌株中分別出現(xiàn)6處、7處和28處突變[4]。另一方面，在多次連續(xù)傳代的過程中，擁有負(fù)突變基因的衰退型細(xì)胞會更快地增殖并占據(jù)優(yōu)勢地位，從而使整個(gè)群體出現(xiàn)相關(guān)衰退性狀。在工業(yè)發(fā)酵中用于生產(chǎn)丙酮-丁醇-Tra（ABE）的產(chǎn)溶劑tic梭菌在多次連續(xù)傳代過程中失去了生產(chǎn)溶劑的能力[5]。經(jīng)過研究鑒定，對于多次繼代培養(yǎng)的平菇來說，其菌絲體中DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)尤其是同源重組修復(fù)的雙鏈斷裂受損，從而導(dǎo)致菌株退化[6]。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件對菌種退化的影響巨大，其中，溫度、pH值、濕度、通氣量等是培養(yǎng)條件的重要衡量指標(biāo)，氧氣、營養(yǎng)、保存溫度等是保存條件的衡量指標(biāo)。在固定其他變量的條件下，可以篩選出某微生物菌種的最佳單一變量。即便對于同種微生物，也可能出現(xiàn)不同表型，而某些表型常被視為退化菌株的特征。例如，食用菌繁殖時(shí)通常會分泌多種胞外酶用來分解有機(jī)物，如纖維素酶、果膠酶及半纖維素酶等[7]，不合適的培養(yǎng)條件會造成菌種退化，常常表現(xiàn)為長勢差、出菇遲、產(chǎn)量下降、質(zhì)量變差、抗性減弱等[8]；在繁殖階段也通常出現(xiàn)色素產(chǎn)量增加、子實(shí)體扭曲等現(xiàn)象[9-12]。

在菌種篩選工作中，培養(yǎng)基不合適會造成篩選工作困難，短期內(nèi)極易誤認(rèn)為是保存條件不適宜而導(dǎo)致的菌種退化。若培養(yǎng)基中提供的有機(jī)物能直接被微生物利用，那么某些具有特殊有機(jī)物降解能力的微生物將不再消耗多余的能量合成降解特殊有機(jī)物的酶，乳糖操縱子試驗(yàn)便很好地證明了該觀點(diǎn)，這也曾經(jīng)被學(xué)者稱為“生物合成的經(jīng)濟(jì)學(xué)效應(yīng)”[13]。當(dāng)然，這與菌種衰退是否具有顯著關(guān)系還需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

已有研究表明，培養(yǎng)基的成分與菌種退化有一定的聯(lián)系。當(dāng)培養(yǎng)基成分單一或者缺乏菌種所需的營養(yǎng)成分時(shí)，可能導(dǎo)致菌絲生長率下降。例如，當(dāng)草菇長期在以葡萄糖為主要碳源的培養(yǎng)基上生長時(shí)，可能導(dǎo)致其對碳源吸收率降低而加速菌種退化，而通過更換碳源能提高菌絲對碳源的吸收率[14]。另外，培養(yǎng)基中成分構(gòu)成與菌種代謝活動也有一定的聯(lián)系。鄒芒閣等[15]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基碳氮比對于藥用真菌某些代謝產(chǎn)物多糖產(chǎn)量有一定的影響，并且不同種類的藥用真菌最適碳氮比具有明顯差異，多糖合成量在不同濃度氮源下隨碳源變化而出現(xiàn)不同變化趨勢。但是，培養(yǎng)基碳氮比并不是對所有的菌種代謝活動都具有顯著影響。諸發(fā)會等[16]發(fā)現(xiàn)，利用茯苓菌株作為試驗(yàn)菌種，在不同碳氮比濃度水平的處理下，各組茯苓菌株子實(shí)體形成無顯著差異。培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)條件優(yōu)化能較大程度地提高微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率、提高菌種活力、延緩菌種退化，而不同的微生物種類對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不同，所采用的培養(yǎng)基配方也各不相同。因此，培養(yǎng)基配方在延緩菌株衰退的科研工作中有重要意義。

1.4 雜菌污染導(dǎo)致基因重組

在培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件不良或者操作條件不嚴(yán)格而導(dǎo)致雜菌污染，也會出現(xiàn)菌種退化風(fēng)險(xiǎn)。因?yàn)橐坏┏霈F(xiàn)雜菌污染并且在培養(yǎng)基中出現(xiàn)雜菌菌落，就有可能導(dǎo)致雜菌細(xì)胞部分片段的DNA被所篩選目的菌吸收，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，有可能會改變所篩選菌種的基因型，若被整合的片段涉及相關(guān)酶合成基因，菌種便會發(fā)生一定程度的衰退。然而，雜菌污染導(dǎo)致菌株生活力下降并不意味著菌種一定發(fā)生了退化，當(dāng)雜菌數(shù)大量增加時(shí)，會占據(jù)有利空間和營養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致目的菌數(shù)下降，這與真正的菌種退化有一定的區(qū)別，通過劃線分離的方法一般可以檢驗(yàn)產(chǎn)量下降是否是由于雜菌污染[17]導(dǎo)致的。

1.5 噬菌體感染導(dǎo)致菌種退化

大量研究表明，噬菌體侵染也能導(dǎo)致菌種退化。以潛伏感染為主要特征的病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，噬菌體的遺傳物質(zhì)會整合至宿主DNA上以緩慢的增殖速度存在于宿主細(xì)胞，在此過程中有可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞相關(guān)酶基因或相關(guān)化學(xué)物質(zhì)合成基因替換或者失活，從而導(dǎo)致菌種退化。另外一種情況便是在某種特定遺傳或者生態(tài)環(huán)境條件變化下，宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒顆粒復(fù)制驟增[18]，病毒顆粒數(shù)目通過爆炸式增長并在宿主細(xì)胞中失控表達(dá)而導(dǎo)致宿主細(xì)胞生活力下降。對于某些食用菌來說，菌絲生長明顯受阻，長勢下降，表現(xiàn)為菌絲體退化等明顯特征；對于纖維素、木質(zhì)素分解菌來說，會出現(xiàn)產(chǎn)酶量低、菌落少而暗淡、活性差等一系列特征。

1.6 核型改變導(dǎo)致菌種退化

某些食用菌在生長過程中會產(chǎn)生菌種異核現(xiàn)象，而核型改變可導(dǎo)致菌種遺傳變異的發(fā)生，出現(xiàn)菌種退化現(xiàn)象[19]。具有不同遺傳性的核共存于同一細(xì)胞，極有可能導(dǎo)致遺傳性狀改變。另外，某些真菌如香菇具有特殊的生殖方式，即四極性異宗結(jié)合。這樣的結(jié)合方式使相同極性的孢子結(jié)合不可育，不能發(fā)育形成子實(shí)體，這一類菌絲最后將形成單核體，造成菌種退化[20]。

2 預(yù)防、延緩菌種退化的措施

菌種退化是遺傳因素與環(huán)境因素的綜合作用而產(chǎn)生的結(jié)果，對菌種退化現(xiàn)象的預(yù)防措施不能僅從單方面進(jìn)行分析、考量，應(yīng)綜合考慮展開。

2.1 創(chuàng)造科學(xué)的保存條件

引起菌種退化的外界環(huán)境因素眾多，其中溫度是最主要的影響因素，其作用原理是通過控制細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)速率，從而對細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響。細(xì)胞在代謝旺盛時(shí)，繁殖速率相應(yīng)提高，其過程中出現(xiàn)的突變也會相應(yīng)增多。例如，在大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型中，溫度升高會導(dǎo)致其突變率顯著提高。因此，通過控制溫度能降低菌種退化概率，據(jù)此衍生出的最有效的技術(shù)便是菌種保存技術(shù)，目前國內(nèi)外公認(rèn)防止菌種退化的最好辦法是采用液態(tài)氮超低溫保存[21]，而短暫保存時(shí)通常采用低溫保存，但低溫保存時(shí)間不宜過長。

在現(xiàn)有低溫保存技術(shù)下，通過加入各類輔助試劑被證明有更好的保存效果。例如，以甘油、海藻酸鈉和二甲基亞砜為低溫保護(hù)劑，采用真空冷凍干燥法制備厭氧氨氧化菌粉對于厭氧氨氧化菌的復(fù)壯效果最佳[22]，以半固體穿刺保存法保存工程大腸桿菌能達(dá)到1年左右的保存時(shí)間，對于某些菌種時(shí)間則更長[23]。以載體法對硝化細(xì)菌進(jìn)行保存時(shí)，加入亞硝酸鹽有著更好的效果，此外還有空氣阻隔法、避光法等[24]。朱華玲等發(fā)現(xiàn)以0.1%PEG-6000水溶液保存法對多種真姬菇菌的保藏效果最佳[25]。周龍洋等研究不同保藏方法對66種真菌的保存效果，結(jié)果表明，對于短期保藏需求，斜面移植法效果較好；對于長期保存需求，液狀石蠟保存法及白膠塞封口法有更好的效果[26]。

2.2 菌種復(fù)壯

對于已經(jīng)出現(xiàn)退化的菌種，可通過菌種復(fù)壯方法，及時(shí)分離正常菌株并對其純化，避免退化菌株占據(jù)優(yōu)勢而使整批菌種完全退化。王殿振等[27]利用菌種北蟲草為試驗(yàn)材料，進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)得到目的退化菌種，采用多種復(fù)壯方法諸如蠶蛹回接法、孢子分離法、組織分離復(fù)壯法等進(jìn)行菌種復(fù)壯，通過對比經(jīng)復(fù)壯后菌種與未經(jīng)復(fù)壯菌種菌絲日均生產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)在各種菌種復(fù)壯方法中以蠶蛹回接法效果最佳。夏淑春等[28]利用蛹蟲草菌種為試驗(yàn)材料，分別采用基內(nèi)菌絲分離法、分生孢子分離法、子囊孢子分離法等進(jìn)行菌種復(fù)壯，對比各種復(fù)壯方法下菌絲生長量，發(fā)現(xiàn)子囊孢子分離法和蠶蛹回接法復(fù)壯效果顯著優(yōu)于分生孢子分離法?？阻麒萚29]利用草菇作為試驗(yàn)材料，通過添加外源氨基酸對菌株進(jìn)行培養(yǎng)，以探究外源氨基酸的潛在復(fù)壯作用，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加外源絲氨酸可顯著降低菌株中活性氧含量。

2.3 防止雜菌污染

對于菌種退化的預(yù)防不能僅從菌種考慮，對于外在環(huán)境的嚴(yán)格控制在眾多的科學(xué)研究及發(fā)酵生產(chǎn)中被證明更具科學(xué)性及可行性。在發(fā)酵工業(yè)中，外源污染是對菌種影響較大的重要因素之一，這也是導(dǎo)致工業(yè)發(fā)酵菌種目的產(chǎn)物產(chǎn)量降低的重要因素，包括雜菌污染導(dǎo)致發(fā)酵菌株優(yōu)勢地位被雜菌取代造成產(chǎn)量下降以及噬菌體感染菌株導(dǎo)致菌株衰退而影響產(chǎn)量。對于噬菌體感染的防治在近年來得到了一定的突破。張高娜等[30]研究發(fā)現(xiàn)，對于噬菌體增殖感染發(fā)酵菌現(xiàn)象的預(yù)防，添加0.5%草酸或0.5%檸檬酸具有較好的效果。另外，選育抗噬菌體的優(yōu)良菌株對于解決噬菌體感染也有積極意義。抗噬菌體選育有多種方法，其中通過自然誘變的方式得到優(yōu)良菌株已被多次報(bào)道[31]。對于雜菌污染的防治，在發(fā)酵、食品工業(yè)中早已形成完善的措施體系。例如，在食用香菇培育過程中，一般通過選育優(yōu)良菌種和嚴(yán)格無菌操作實(shí)現(xiàn)雜菌污染防治。在選育優(yōu)良菌種方面，通常選育具有菌絲旺盛、色澤潔白等特征的菌種；在嚴(yán)格無菌操作過程中，利用高錳酸鉀與甲醛以1∶2混合后對操作空間進(jìn)行消毒殺菌在多年的菌株生產(chǎn)中被證明是極為有效的[32]。

3 結(jié)語

目前，對于菌種退化的預(yù)防及延緩，人們提出了各種合理的方法措施，但主要圍繞環(huán)境因素切入，并且更多體現(xiàn)在工業(yè)發(fā)酵、食品工業(yè)等與人類生活息息相關(guān)的方面。然而，由自發(fā)突變導(dǎo)致的退化問題目前仍然沒有比較好的解決方案，僅提出了一些相關(guān)建議，如利用某些代謝過程抑制劑如SOS阻斷劑等阻斷相關(guān)反應(yīng)，利用基因工程的方法對微生物性狀進(jìn)行改良并保證其穩(wěn)定性。但是，在微生物生理代謝機(jī)制及菌種退化控制方法等新技術(shù)上的研究甚少?？傊壳皩τ诰N退化的研究仍然是有限的，需要眾多的科研工作者不懈努力，最終改善甚至解決菌種退化問題。