劉李婷 馬佩

1（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院農(nóng)副食品所，陜西西安 710048）

2（西安正大制藥有限公司，陜西西安 710043）

葛根素，也叫做葛根黃素，分子式為C21H20O9，易溶于甲醇，略溶于乙醇，微溶于水，屬于異黃酮類化合物，具有擴(kuò)張血管、抑制血小板凝集、降血壓的作用。目前，葛根素的提取方法主要有超聲提取法、微波輔助提取法、索氏提取法、回流提取法。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，回流提取葛根素效果最佳。但目前回流提取時(shí)間較長(zhǎng)，制備工藝繁瑣。本研究的提取方法無(wú)需藥材前期處理，乙醇提取溶劑無(wú)毒、廉價(jià)易得，提取過(guò)程易于操作。通過(guò)恒溫加熱乙醇回流提取粉葛中葛根素，設(shè)定提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比3 個(gè)因素，正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝，以葛根素的提取率作為考察指標(biāo)，HPLC 測(cè)定提取物中葛根素含量，得出最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

粉葛粉：購(gòu)于陜西眾信醫(yī)藥藥店，陜西盤(pán)龍藥業(yè)。

1.2 試劑與儀器

試劑：甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；超純水；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98.0%，上海標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司。

儀器：98-1-8 電熱套，天津市泰斯特儀器公司；RE-5298 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器；SPD-20A 高效液相色譜儀，日本島津儀器有限公司；KQ-500E 超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 提取工藝及測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取1.0 000 g 粉葛粉，用干燥濾紙包嚴(yán)防止灑漏，放入茄形燒瓶中加入定量乙醇，電熱套恒溫加熱回流提取葛根素，所得提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50 ℃蒸干。加入70%甲醇溶液充分溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?0 mL。用孔徑0.45μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，HPLC測(cè)定葛根素含量。

1.4 提取工藝優(yōu)化

以回流時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比為主要影響因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以粉葛中葛根素提取率為判定標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化葛根素提取工藝。

1.5 儀器條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：甲醇-水（30:70）；流速：1.0 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取干燥的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用70%甲醇溶液溶解并定容至5 mL，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

吸取1 mL儲(chǔ)備液用70%甲醇溶液定容至10 mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)使用液，質(zhì)量濃度為100μg/mL。分別吸取0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液，用70%甲醇溶液定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，得到回歸方程：y=81 683x-43 488，R2=0.999 2。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 回流時(shí)間對(duì)提取率的影響

取1 g 樣品，用濾紙包好，固液比為1:10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，于加熱套上分別回流1 h、2 h、3 h、4 h，提取液經(jīng)50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用70%甲醇溶液溶解并定容至50 mL，HPLC測(cè)定含量?；亓鲿r(shí)間對(duì)葛根素提取率的影響見(jiàn)圖2。

如圖2 所示，回流提取時(shí)間越長(zhǎng)，葛根素質(zhì)量濃度明顯上升，葛根素提取率呈指數(shù)型增長(zhǎng)，最高達(dá)到179.78μg/100g。當(dāng)回流時(shí)間超過(guò)3 h 后，葛根素質(zhì)量濃度略有降低，其提取率也略有下降，其原因可能是加熱時(shí)間長(zhǎng)葛根素會(huì)發(fā)生分解。因此，選擇回流提取時(shí)間為3 h。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

取1 g 樣品，用濾紙包好，分別使用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%、100%乙醇溶液提取，固液比為1:10，于加熱套上回流1 h，提取液經(jīng)50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用70%甲醇溶液溶解并定容至50 mL，HPLC 測(cè)定葛根素含量。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根素提取率的影響見(jiàn)下頁(yè)圖3。

如圖3 所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)從50%逐漸遞增到90%，葛根素質(zhì)量濃度也隨之不斷升高，提取率明顯上升，其原因是蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)會(huì)在較高濃度的乙醇溶液中部分沉淀而除去。乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，葛根素提取率高達(dá)121.86μg/100g。當(dāng)繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，葛根素提取率下降。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%。

2.2.3 固液比對(duì)提取率的影響

取1 g 樣品，用濾紙包好，使用70%乙醇溶液提取，固液比分別為1:5、1:8、1:10、1:12，于加熱套上回流1 h，液體經(jīng)50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用70%甲醇溶液溶解并定容至50 mL，HPLC測(cè)定葛根素含量。固液比對(duì)葛根素提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

如圖4 所示，隨著固液比的遞增，葛根素質(zhì)量濃度升高不明顯，僅增加2.27%。固液比為1∶10時(shí)，葛根素提取率提高了28.71μg/100g。而當(dāng)固液比為1:12 時(shí)，葛根素質(zhì)量濃度和提取率均下降。因此，選擇固液比為1∶10。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

為了整體考察各因素條件對(duì)葛根素提取率的影響，以回流時(shí)間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、固液比（C）為主要影響因素，葛根素提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行了3 因素4 水平正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平設(shè)計(jì)

由表2中R值分析可知，影響葛根素提取率的主次因素依次為C＞B＞A，即固液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞回流時(shí)間。由極差分析可知，優(yōu)化工藝條件為A3B3C4，回流時(shí)間為3 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，固液比1∶12。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 總結(jié)

本試驗(yàn)優(yōu)化了恒溫加熱回流提取粉葛中有效成分葛根素的工藝參數(shù)。以葛根素提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。提取過(guò)程中，選擇乙醇溶液作為提取溶劑，原料廉價(jià)易得，且無(wú)毒。采用高效、高靈敏度HPLC 法測(cè)定葛根素含量。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)從葛根素有效成分的提取及減少消耗、省時(shí)高效等方面考慮，通過(guò)數(shù)據(jù)分析得到最佳工藝參數(shù)。