龍駿 張連生 顧春楓 章英彰 嚴萍

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見的呼吸系統(tǒng)多發(fā)病[1]，臨床癥狀常表現(xiàn)為持續(xù)咳嗽、呼吸困難及黏液增多等，通常伴有不完全可逆的持續(xù)性氣流受限的特征，病情通常會隨著疾病發(fā)展而加重。在外來有害氣體或顆粒的刺激下，易引起肺組織與氣道的炎癥反應(yīng)，造成程度不一的肺功能損害，甚至?xí)＜案文I系統(tǒng)，造成呼吸困難并引起全身炎癥反應(yīng)，情況嚴重者甚至?xí)绊懷h(huán)、中樞神經(jīng)[2]。有文獻報道，COPD 的死亡率極高，在疾病急性加重期，會造成肺部炎癥反應(yīng)劇烈繼而導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)加劇，致殘率、致死率急劇升高，是有關(guān)患者身心健康和預(yù)后的關(guān)鍵[3]。目前國內(nèi)就痰熱清聯(lián)合N-乙酰半胱氨酸對老年慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）患者血清白細胞介素（interleukin，IL）-33/可溶性基質(zhì)裂解素2（soluble matrix lysin 2，sST2）軸表達的影響鮮有報道，故本次研究展開臨床對照性研究，分析其治療效果以及可能起效機制?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年9 月至2019 年9 月桐鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院和紹興市上虞人民醫(yī)院接受治療的老年AECOPD 患者122 例，其中男性66 例、女性56 例；年齡65～87 歲，平均（75.88±6.09）歲；體重指數(shù)（body mass index，BMI）22.15～26.88 kg/m2，平均（24.79±1.13）kg/m2；吸煙者80 例、不吸煙者42 例。納入標準包括：①經(jīng)診斷均符合《慢性阻塞性肺疾病診療指南》[4]中有關(guān)COPD 的相關(guān)標準；②中醫(yī)診斷符合《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[5]制定肺脾腎虛、痰瘀互結(jié)證，并經(jīng)至少2 位職稱中級及以上的中醫(yī)師共同辯證；③病程處于急性加重期，患者呼吸系統(tǒng)癥狀惡化，超出日常變異；④年齡在65 歲以上。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者及其家屬同意且簽署知情同意書。并剔除：①對本試驗使用藥物所含成分過敏者及易過敏體質(zhì)者；②合并有嚴重的血液病、神經(jīng)系統(tǒng)及肝腎功能具有重大疾病者；③合并有肺癌、哮喘、活動性肺結(jié)核等肺部其他疾病者；④智力低下及精神障礙，無法配合治療，無法進行隨訪者；⑤伴有炎癥性腸病、紅斑狼疫及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病者。按照隨機數(shù)字表法分為治療組（61 例）與對照組（61 例）。兩組基線資料比較見表1。兩組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 兩組基線資料比較

1.2 方法 所有患者治療前行相關(guān)檢查，根據(jù)病情及病情變化給予營養(yǎng)支持，同時予注射液多索茶堿針劑（由成都百裕制藥股份有限公司生產(chǎn)）0.2 g +100 ml 0.9%氯化鈉注射液靜滴解痙平喘，每日2 次；予注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（由重慶華邦制藥有限公司生產(chǎn)）40 mg+250 ml 0.9%氯化鈉注射液靜滴祛痰鎮(zhèn)咳，每日1 次；予注射用頭孢唑肟鈉（由廣州白云山天心制藥股份有限公司生產(chǎn)）2 g+250 ml 0.9%氯化鈉注射液靜滴抗感染治療，每日1 次；無創(chuàng)正壓通氣采用ST 模式，每天2 次，均持續(xù)7 d。在此基礎(chǔ)上，對照組予乙酰半胱氨酸膠囊（由廣東人人康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）0.2 g口服，每日3 次，并維持用藥7 d。治療組在對照組治療基礎(chǔ)上予痰熱清注射液（由上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）20 ml+0.9%氯化鈉液250 ml 靜脈滴注，每日1 次，持續(xù)治療7 d。整個研究過程中須嚴格監(jiān)督患者，確保其按規(guī)定服藥，若治療過程中伴有藥物相關(guān)毒副反應(yīng)立刻告知醫(yī)生。

1.3 觀察指標

1.3.1 IL-33、sST2 mRNA 水平檢測 于治療前后抽取患者清晨6∶00 空腹靜脈血5 ml，置于有抗凝劑的試管內(nèi)，采用Trizol 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在定量PCR 儀（購自于上海賽默科技生物發(fā)展有限公司）中對IL-33、sST2 進行擴增，采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法對其mRNA 水平進行檢測。以Primer 軟件設(shè)計引物，目的基因mRNA 相對表達水平為2-ΔΔCt（見表2）。每個樣品進行3 次生物學(xué)重復(fù)實驗以確保數(shù)據(jù)準確性。

表2 Real time-PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.3.2 IL-33、sST2蛋白表達水平檢測 在將200 μl紅細胞裂解液加入外周血后，再置入預(yù)冷EP 管，上孵育20 min 后，以3 000 r/min 離心10 min，收集上清液為細胞裂解液。用蛋白質(zhì)定量試劑盒法為RIPA 提取蛋白，進行蛋白定量，用蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度后，在剩余蛋白樣品中添加等體積的2×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液，經(jīng)過5 min 的沸水煮后，再進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直電泳分離，上樣量為30 μg/孔，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至聚偏氟乙烯膜，5%TBS-T 脫脂奶粉封閉，室溫振蕩60 min，最后加入1∶3000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗鼠或抗兔的二抗室溫孵育過夜，置化學(xué)發(fā)光試劑中于室溫下振蕩溫育5 min，置于X光片盒中感光顯影。設(shè)β-actin 為內(nèi)參照基因，使用相應(yīng)軟件進行條帶的半定量分析，紀錄各條帶積分光密度值。

1.3.3 IL-33/sST2 軸相關(guān)炎癥細胞因子檢測 于治療前后抽取患者空腹靜脈血，置于離心機上以3 000 r/min 轉(zhuǎn)離心5 min，分離血清，血清中IL-4、IL-5、IL-10 等水平均采用酶聯(lián)免疫吸附法進行檢測，采用廈門慧嘉生物科技有限公司生產(chǎn)試劑盒。

1.3.4 動脈血氣指標檢測 采用瑞士羅氏Omin-C型血氣分析儀測定患者血氧飽和度（blood oxygen saturation，SaO2）、動脈二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）等水平。

1.3.5 肺功能指標檢測 采用德國epoc Reader 型肺功能測定儀測定患者氣道峰壓（peak airway pressure，Ppeak）、呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）、一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）占用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）百分比等水平。

1.3.6 不良反應(yīng) 記錄兩組治療期間出現(xiàn)的藥物相關(guān)不良反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。組間計量資料比較采用t 檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后IL-33、sST2 mRNA 和蛋白表達比較見表3

表3 兩組治療前后IL-33、sST2 mRNA和蛋白表達比較

由表3 可見，治療前，兩組IL-33、sST2 mRNA和蛋白比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t 分別=0.25、0.43、0.57、0.42，P 均＞0.05）；治療后，治療組IL-33、sST2 mRNA 和蛋白低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別=10.00、6.80、10.30、11.26，P均＜0.05）。

2.2 兩組治療前后IL-33/sST2 軸相關(guān)炎癥細胞因子比較見表4

表4 兩組治療前后IL-33/sST2軸相關(guān)炎癥細胞因子比較/pg/ml

由表4 可見，治療前，兩組IL-4、IL-5、IL-10 比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t 分別=0.78、1.85、0.31，P均＞0.05）；治療后，治療組IL-4、IL-5、IL-10 高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t 分別=17.95、7.55、7.79，P均＜0.05）。

2.3 兩組治療前后動脈血氣指標比較見表5

表5 兩組治療前后動脈血氣指標比較

由表5 可見，治療前，兩組SaO2、PaCO2、PaO2比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t 分別=0.36、0.39、0.87，P均＞0.05）；治療后，治療組PaCO2低于對照組，SaO2、PaO2高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t 分別=-5.02、11.40、7.12，P均＜0.05）。

2.4 兩組治療前后肺功能指標比較見表6

表6 兩組治療前后肺功能指標比較

由表6 可見，治療前，兩組患者的Ppeak、PEF、FEV1/FVC 比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t 分別=0.07、0.80、0.04，P 均＞0.05）；治療后，治療組Ppeak、PEF、FEV1/FVC 高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t 分別=6.59、7.06、7.34，P均＜0.05）。

2.5 兩組不良反應(yīng)比較見表7

表7 兩組不良反應(yīng)比較/例（%）

由表7 可見，治療組與對照組不良反應(yīng)發(fā)生例數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.26，P＞0.05）。

3 討論

IL-33 是由人源基因IL-33 編碼的蛋白[6]，往往富集于氣道和胃腸道上皮細胞，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多種病理過程中扮演著尤為關(guān)鍵的角色。有國外學(xué)者通過收集來源于15 個疾病中心的307 例穩(wěn)定期COPD 患者并對其外周血中的IL-33 水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)其水平與嗜酸性粒細胞計數(shù)和慢性支氣管炎表型方面密切相關(guān)[7]。因此，可以推斷出COPD 的發(fā)生與IL-33 高表達有密切關(guān)系并且會誘使炎癥擴大。IL-33 的受體為ST2，其有兩種主要的由不同啟動子調(diào)控的初級亞型：跨膜型（ST2L）、分泌型（sST2），其中IL-33與sST2會出現(xiàn)競爭性結(jié)合，阻滯Toll 樣受體-IL-1 受體信號途徑的負性調(diào)節(jié)進程，以調(diào)節(jié)與Th2免疫反應(yīng)相關(guān)細胞因子（主要包括IL-4、IL-5、IL-33 等具有抗炎效應(yīng)的細胞因子）的轉(zhuǎn)錄，故而IL-33/sST2 軸異?？蓞⑴c多種病理過程，包括變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫疾病等[8]。在過敏性哮喘小鼠模型中，抑制Th2 產(chǎn)生細胞因子的目標可通過阻斷IL-33/sST2 信號通路來實現(xiàn)，研究者認為目前可將以IL-33/sST2軸為靶點作為有效抑制肺部疾病惡化的手段之一[9]。

本次研究結(jié)果顯示，經(jīng)治療后，治療組IL-33、sST2 mRNA 和蛋白均低于對照組，而IL-4、IL-5、IL-10 則高于對照組（P 均＜0.05），提示聯(lián)合治療對改善老年AECOPD 機體抗/促炎因子失衡狀態(tài)有良好效果，有助于恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)。N-乙酰半胱氨酸是現(xiàn)階段臨床治療AECOPD 的有效藥物，其含有的硫氫基可與細菌細胞壁蛋白結(jié)合，競爭性抑制細菌利用半胱氨酸，進而發(fā)揮較佳的抑菌效應(yīng)，同時該藥亦能夠抑制和破壞細菌生物膜的形成，幫助抗生素穿透生物膜，加強其效用。此外，N-乙酰半胱氨酸對降低細菌黏附性也有明顯效果，以利于其排除。N-乙酰半胱氨酸可能通過以上機制發(fā)揮抗感染作用，從而改善由感染引起的氣道高炎癥狀態(tài)[10]。

痰熱清主要是由黃芩、山羊角、連翹、金銀花及熊膽粉等提煉而成。現(xiàn)代藥理學(xué)認為，其不僅存在抗菌作用既可抑制細菌細胞壁合成，亦對中性粒細胞的吞噬功能有明顯增強作用，可緩解早期毛細血管的炎性水腫與滲出并降低其通透性，從而起到提高機體免疫狀態(tài)的效果[11]。本次研究結(jié)果亦顯示，經(jīng)治療后，治療組Ppeak、PEF、FEV1/FVC 以及SaO2、PaO2高于對照組，而PaCO2則低于對照組（P 均＜0.05），提示痰熱清聯(lián)合N-乙酰半胱氨酸能夠明顯提高老年AECOPD 患兒呼氣、吸氣能力，利于呼吸系統(tǒng)功能恢復(fù)和改善，臨床療效確切，這與胡光煦等[12]的研究結(jié)果相一致。分析原因：痰熱清作為一種中藥復(fù)方注射劑，其中黃岑、山羊角、熊膽、金銀花、連翹等成分均具有抗菌消炎的功效，可參與免疫反應(yīng)的不同階段[13]，在慢反應(yīng)階段，其可促進B 淋巴細胞增殖，從而調(diào)節(jié)體液免疫功能，在快反應(yīng)階段，對中性粒細胞可明顯提高其吞噬能力，對Th1/Th2 的功能失衡有著一定調(diào)節(jié)作用。本次研究對用藥安全性進行展開研究，發(fā)現(xiàn)兩組所發(fā)生的不良反應(yīng)發(fā)生例數(shù)比較并無明顯差異（P＞0.05），證實對于老年AECOPD 的治療，相比于延長治療時間與提高藥物用量，聯(lián)合用藥的效果明顯更佳。

綜上所述，痰熱清聯(lián)合N-乙酰半胱氨酸可明顯改善老年AECOPD 患者臨床癥狀，延緩肺功能下降，利于病患預(yù)后的優(yōu)化，療效明顯，其機制可能與抑制IL-33/sST2 軸的活化及相關(guān)炎癥因子釋放有關(guān)。本次研究也存在樣本數(shù)較少，同時未對肺功能、動脈血氣指標、IL-33/sST2 軸相關(guān)炎癥細胞因子以及IL-33、sST2 mRNA 和蛋白等進行動態(tài)觀察等缺點，因此仍需進一步的研究加以證實。