吳 娜 李永霞

1.宏基因二代測序概況

宏基因二代測序(metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS)，也叫作高通量測序,是利用通量較高的二代測序技術(shù)對送檢樣本中所有微生物基因獨(dú)立或并行測序，測序深度大、覆蓋面廣、運(yùn)行效率高。目前mNGS成本下降了近50000倍，而測序數(shù)據(jù)量增加1000倍左右[1]，促進(jìn)了其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛利用。mNGS目前可用于病原微生物的鑒定、醫(yī)院感染性疾病暴發(fā)的調(diào)查、未知病原體的檢測、毒力分析、耐藥基因組的研究等方面[2～4]。2008年P(guān)alacios等[5]采用宏基因組發(fā)現(xiàn)了新發(fā)病原體沙粒病毒，2011年Xu等[6]相繼采用宏轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)新型布尼亞病毒，開啟了mNGS技術(shù)在感染中應(yīng)用的先例。在2014年，CY Chiu教授[7]應(yīng)用mNGS成功診斷了不明原因發(fā)熱的14歲男童罹患鉤端螺旋體，Wilson將此病例發(fā)表，mNGS成為肺部感染病原學(xué)診斷的研究熱點(diǎn)，也應(yīng)用于其他系統(tǒng)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[8]、感染性心內(nèi)膜炎[9]、感染性胰腺壞死[10]、人工關(guān)節(jié)感染[11]等。肺部感染作為感染性疾病中發(fā)病率最高的疾病，也成了mNGS應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域。

2. mNGS在肺部感染不同病原體中的診斷效能

2.1 細(xì)菌 肺部感染80%以上為細(xì)菌感染。肖光榮等[12]研究表明革蘭陰性菌占76.7%，革蘭陽性菌占16.1%，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)占革蘭陽性菌的73.8%。排名前五位的分別為肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌。肺部細(xì)菌感染病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為傳統(tǒng)培養(yǎng)和涂片鏡檢，但病原菌檢出陽性率低且培養(yǎng)耗費(fèi)時間較長。mNGS技術(shù)為肺部感染病原學(xué)診斷提供新的方法。李思云[13]的研究共納入44例患者，其中22例為細(xì)菌感染，mNGS診斷細(xì)菌陽性率為81.82%高于傳統(tǒng)方法(63.64%)，P>0.05。這一結(jié)果表明mNGS在診斷細(xì)菌感染方面陽性率高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，但差異不明顯。Ying Li[14]等人的研究得出，在細(xì)菌診斷方面mNGS對比培養(yǎng)法靈敏度及特異度分別為88.89%及74.07%，mNGS對比涂片法的靈敏度及特異度是100%及77.78%。鈕月英[15]等的研究比較了mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測的病原體分布發(fā)現(xiàn)，僅有鮑曼不動桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)檢出例數(shù)較mNGS多，而肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌等其他細(xì)菌mNGS檢出例數(shù)明顯多于傳統(tǒng)培養(yǎng)。除陽性率高之外，mNGS檢測結(jié)果不受使用抗生素的影響，潘春熹[16]等的研究表明檢測前未使用過抗生素組兩方法檢出率無明顯差異，而檢測前使用抗生素大于3天組mNGS陽性率顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)。由此可見，在診斷細(xì)菌方面mNGS優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)和涂片鏡檢，但特異性不高。在未來的研究中，mNGS為新型診斷技術(shù)研究和藥物研發(fā)提供有力的支持，利用mNGS檢測微生物表達(dá)產(chǎn)物的RNA-seq讀數(shù)可以把感染、定植和活菌與死菌區(qū)別出來,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷，還可以通過監(jiān)測耐藥菌基因變化找到突變位點(diǎn)，對后期耐藥菌抗生素的研發(fā)有指導(dǎo)意義[17]。

2.2 厭氧菌 不明原因的肺部感染中，厭氧菌占據(jù)不可忽視的地位，而且厭氧菌感染是引起感染性休克的主要原因之一[18]。傳統(tǒng)檢測方法為厭氧培養(yǎng)，由于厭氧菌生長條件極為苛刻，培養(yǎng)陽性率低。李冰[19]等關(guān)于mNGS對厭氧菌感染精準(zhǔn)化診斷的研究表明，菌屬水平最常見的菌屬為普氏菌屬、梭桿菌屬、卟啉單胞菌屬，菌種水平最常見的菌種為中間普氏菌和具核梭桿菌。該研究納入16例患者共29份微生物標(biāo)本，分別同時進(jìn)行厭氧菌培養(yǎng)和mNGS檢測，結(jié)果顯示肺部感染厭氧菌培養(yǎng)陽性率為7.14%(1/14)，而mNGS檢測陽性率為71.43%(10/14),P=0.001,兩者間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；從微生物標(biāo)本送檢至結(jié)果報(bào)告，培養(yǎng)所需平均時間為(81.27±7.94)h，約為mNGS檢測所需的平均時間[(39.66±15.09)h]的2倍(P<0.05)。因此，mNGS在厭氧菌感染的快速、精準(zhǔn)化診斷中具有明顯優(yōu)勢。

2.3 病毒 上呼吸道感染病原體絕大多數(shù)為病毒，而下呼吸道病毒感染比較隱匿，常常與細(xì)菌、支原體等混合感染。部分病毒傳染性及致病力極強(qiáng)，例如SARS冠狀病毒導(dǎo)致的重癥急性呼吸綜合征、MRES-CoV導(dǎo)致的中東呼吸綜合征等。其他常見的病毒有單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒等。目前病毒感染檢測方法有抗原檢測、RT-PCR、病毒分離、血清特異性IgG及IgM抗體測定等，血清特異性抗體測定是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，目前檢測方法只能檢測已知的目標(biāo)病原體，無法識別新發(fā)、變異的病毒。mNGS技術(shù)能夠檢測到樣本中所有的病毒基因序列，從而識別出新型病毒，還能夠通過比對基因序列找到變異位點(diǎn)，協(xié)助尋找中間宿主及病毒起源[20]。此外，對于其他常見病毒mNGS陽性率高于傳統(tǒng)方法。李思云[13]研究納入44例不明原因肺部感染患者，有13例為病毒感染，mNGS陽性率為84.62%(11/13)，而傳統(tǒng)方法陽性率僅為38.46%(5/13)，P<0.05，可認(rèn)為mNGS診斷病毒陽性率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。馬彩霞[21]等的研究將47例確診兒童重癥支原體肺炎的支氣管肺泡灌洗液同時進(jìn)行傳統(tǒng)病原檢測和mNGS，結(jié)果47例患者兩種方法肺炎支原體檢測均為陽性，不同的是mNGS 23例(48.9%)檢出混合感染，而傳統(tǒng)檢測僅2例(4.3%)檢出混合感染，mNGS檢測出混合感染最多的病原體為腺病毒7型(11例，23.4%)，而傳統(tǒng)檢測僅1例腺病毒抗原呈現(xiàn)弱陽性。mNGS不僅檢測病毒陽性率高，還能夠通過序列數(shù)判斷肺部病變嚴(yán)重程度?？娗郲22]等關(guān)于mNGS檢測呼吸道病毒的臨床應(yīng)用研究得出，RPKM參數(shù)(每100萬個序列每100bp，匹配上的序列數(shù))與PO2、CD4/CD8比值呈負(fù)相關(guān)，而與肺部病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。由此可見mNGS對病毒感染及病毒混合感染具有很顯著的優(yōu)勢，且基因序列能早期進(jìn)行病毒分型，檢測序列數(shù)可分析病毒載量評估病情。

2.4 真菌 肺部真菌感染常繼發(fā)于免疫功能低下人群，老年人合并基礎(chǔ)疾病、艾滋病及使用抗生素、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑等是其高危因素。近年來肺部真菌感染的發(fā)病率及病死率逐年上升[23]，mNGS提高了真菌感染檢出率。李思云[13]研究納入44例不明原因肺部感染患者，有14例為真菌感染，mNGS陽性率為85.71%(12/14)，傳統(tǒng)方法陽性率50%(7/14)，P>0.05。與此結(jié)果相近的是，李荷蘭對肺活檢組織進(jìn)行mNGS的研究得出，mNGS對比涂片法診斷真菌的靈敏度及特異度分別是62.5%及66.7%，mNGS對比培養(yǎng)法診斷真菌的靈敏度及特異度是57.1%及61.5%。上述研究表明，mNGS診斷真菌陽性率高于傳統(tǒng)方法，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，mNGS在診斷肺曲霉病(PA)和肺孢子菌肺炎(PCP)方面具有顯著優(yōu)勢。賈建超[24]等的研究納入17例傳統(tǒng)病原學(xué)檢測確診真菌感染及3例符合真菌感染臨床診斷患者，收集20例患者肺泡灌洗液行mNGS檢測，20例患者均為陽性，3例符合臨床診斷患者中1例確定為肺孢子菌感染合并白色念珠菌，另外2例為肺孢子菌合并鮑曼不動桿菌感染；傳統(tǒng)方法僅檢出3例曲霉菌，而mNGS檢出6例。另外，顧鵬[25]等的研究選取腎臟疾病使用免疫抑制劑治療后疑診肺孢子菌肺炎(PCP)的患者37例作為實(shí)驗(yàn)組，確診其他病原體所致肺部感染者25例作為對照組，實(shí)驗(yàn)組和對照組均進(jìn)行mNGS檢測，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組35例患者mNGS檢出耶氏肺孢子菌，敏感度為94.59%，特異度為100%，而G試驗(yàn)+GM試驗(yàn)的敏感度及特異度分別為89.19%及56.0%，對照組25例患者均未檢出耶氏肺孢子菌。這一研究結(jié)果表明,mNGS是診斷肺孢子菌肺炎高效而準(zhǔn)確的方法，梁艷[26]等的研究結(jié)論此一致。還有，張堯[27]等的研究以最終診斷為慢性肺曲霉病為金標(biāo)準(zhǔn)，比較了傳統(tǒng)培養(yǎng)、血清煙曲霉特異性抗體Ig G測定、mNGS三種方法的靈敏度、特異度及ROC曲線下面積，結(jié)果三者ROC曲線下面積分別為0.759、0.696、0.608，靈敏度mNGS(65.7%)>血清煙曲霉特異性抗體Ig G測定(48.6%)>傳統(tǒng)培養(yǎng)(28.6%),特異度傳統(tǒng)培養(yǎng)(93.0%)>血清煙曲霉特異性抗體Ig G測定(90.7%)>mNGS(86.0%)。由此可見，mNGS對肺孢子菌及曲霉菌檢出率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法，且檢測肺孢子菌特異度較高即較為準(zhǔn)確，檢測曲霉菌特異度不如傳統(tǒng)培養(yǎng)及血清特異性抗體測定。

2.5 結(jié)核 根據(jù)世界衛(wèi)生組織2020年10月14日發(fā)布的全球結(jié)核病年度報(bào)告，我國2019年新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)約83萬例，位居全球第三位；利福平耐藥結(jié)核病患者數(shù)約6.5萬例，占全球利福平耐藥肺結(jié)核患者的14%，位居全球第二位，是全球結(jié)核感染負(fù)擔(dān)最重的國家之一。肺結(jié)核在結(jié)核病中占比最多，而最近流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肺外結(jié)核的比例不斷增多[28]。臨床中由于結(jié)核培養(yǎng)陽性率低，病原學(xué)診斷十分困難，結(jié)核診斷常借助痰涂片查抗酸桿菌、T-SPOT、PPD試驗(yàn)等輔助檢查。對于涂片及培養(yǎng)多次陰性即所謂“涂陰”及“菌陰”的患者，常常依據(jù)臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)結(jié)合胸部CT典型的影像學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行臨床診斷或診斷性抗結(jié)核治療。目前病原學(xué)確診結(jié)核的方法有傳統(tǒng)培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF分析法。Peixin Chen[29]等人的研究比較了傳統(tǒng)培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF、mNGS三種方法診斷結(jié)核的效能，結(jié)果mNGS診斷結(jié)核的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、約登指數(shù)分別為66.7%、97.1%、96.0%、73.3%、63.8%，靈敏度mNGS(66.7%)>GeneXpert MTB/RIF(61.5%)>傳統(tǒng)培養(yǎng)(36.1%)；以傳統(tǒng)培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，mNGS的約登指數(shù)為88.2%，以GeneXpert MTB/RIF為金標(biāo)準(zhǔn)，mNGS的約登指數(shù)為100%，說明mNGS在確診結(jié)核方面與現(xiàn)有方法一致性較好。這一結(jié)論與Zhou X[30]等人的研究結(jié)果一致，即mNGS與GeneXpert MTB/RIF靈敏度相差不大，但顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)。綜上所述，mNGS是目前檢測結(jié)核靈敏度和特異度最高的方法，且可縮短診斷時間，提高檢測效能。

mNGS的優(yōu)勢還在于區(qū)分結(jié)核與其他抗酸桿菌，抗酸桿菌包括結(jié)核桿菌(TB)、麻風(fēng)桿菌和其他非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，痰涂片查抗酸桿菌不能區(qū)分上述三者，因此臨床中非結(jié)核分枝桿菌感染常常被忽視,而部分NTM也被誤診為結(jié)核。有文獻(xiàn)表明，亞洲人群NTM的發(fā)病率約為39.6例/10萬人年，仍以19例/10萬人年的速度增長，NTM感染已超過TB[31]。然而，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的一項(xiàng)研究顯示NTM的確診率僅為40%左右。由此可見，非結(jié)核分枝感染形勢嚴(yán)峻，快速準(zhǔn)確診斷NTM是有效診治的關(guān)鍵?？娗郲32]等研究表明，傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測NTM陽性率為21.9%，mNGS檢測 NTM陽性率24.7%，P=0.29，二者之間無明顯差異。因此，mNGS在檢測NTM方面優(yōu)勢不明顯，但mNGS檢測時間僅為傳統(tǒng)培養(yǎng)的一半，可早期確定菌種進(jìn)行診治，有利于區(qū)別結(jié)核與其他分枝桿菌感染。

2.6 其他病原體 閱讀文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，mNGS還對肺炎支原體、鸚鵡熱衣原體等非典型病原體感染診斷具有顯著優(yōu)勢。肺炎支原體培養(yǎng)要求較一般細(xì)菌高，而鸚鵡熱衣原體甚至需要細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，因此目前臨床上多采用微量免疫熒光法測血清特異性Ig M抗體進(jìn)行診斷。馬彩霞[21]等的研究將47例確診兒童重癥支原體肺炎的支氣管肺泡灌洗液同時進(jìn)行傳統(tǒng)病原檢測和mNGS，結(jié)果47例患者mNGS肺炎支原體檢測均為陽性，與肺炎支原體PCR檢測完全符合，且mNGS檢測肺炎支原體合并其他病原體感染的檢測效能優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)。駱煜[33]等對通過mNGS診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎的5個病例進(jìn)行個案報(bào)道，5個病例均以高熱、咳嗽收住院，且都有鳥類或家禽接觸史，胸部CT都為單個肺葉的滲出實(shí)變，個別病例甚至出現(xiàn)呼吸衰竭，入院后急行mNGS檢測，發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體序列而確診，及時調(diào)整抗生素為四環(huán)類藥物后病情好轉(zhuǎn)，縮短了鸚鵡熱衣原體感染的診斷時間和病程，有效減少了抗生素的濫用誤用。黃美霞[34]等報(bào)道了一例以“咳嗽伴胸痛”為主訴入院的12歲男孩，CT提示右肺中葉實(shí)變不除外空洞形成，肺泡灌洗液DNA檢測陽性，但灌洗液結(jié)核涂片、結(jié)核感染T細(xì)胞檢測及結(jié)核菌素試驗(yàn)均陰性，肺結(jié)核證據(jù)不足，最終通過mNGS確診了格雷文尼放線菌感染，調(diào)整治療后患者病變吸收好轉(zhuǎn)。目前對于非典型病原體的診斷多集中在個案報(bào)道，期待在未來更多的研究中體現(xiàn)mNGS對非典型病原體的診斷價值。

3.總結(jié)與展望

mNGS可大大提高肺部感染病原體診斷效率。在細(xì)菌感染方面，mNGS靈敏度和特異度均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，但差異不明顯，而對于厭氧菌則具有顯著差異；在病毒感染方面，mNGS可檢測出傳統(tǒng)方法不能識別的新型或未知病毒，可追溯病毒起源及監(jiān)測變異，且對于病毒混合感染具有很高的檢出率，mNGS在病毒感染方面具有十分顯著的優(yōu)勢；對于真菌感染，mNGS在診斷肺曲霉病(PA)和肺孢子菌肺炎(PCP)方面具有顯著優(yōu)勢；在結(jié)核感染方面，mNGS靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)檢測，且能夠區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌感染，mNGS聯(lián)合傳統(tǒng)檢測可提高靈敏度；此外，mNGS對于檢測支原體、鸚鵡熱衣原體、肺放線菌等非典型病原體也具有絕對優(yōu)勢。

目前mNGS的不足之處有以下方面：①費(fèi)用較高，臨床可及性有待提高；②文庫制備缺乏統(tǒng)一、全面、準(zhǔn)確的參照數(shù)據(jù)庫，少見、罕見的病原體可能漏診；③對于有細(xì)胞壁保護(hù)的胞內(nèi)菌檢測靈敏度有望通過有效的破壁處理進(jìn)一步提高。期待隨著mNGS技術(shù)的改進(jìn)，進(jìn)一步提高其在肺部感染中的診斷效率，更加有效的應(yīng)用于臨床。