曾令湖，譚正準(zhǔn)，鄢勝飛，黃 健，李廳廳，李 輝，于農(nóng)淇，盧 瑛，梁莎莎，羅 華，覃廣勝

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧 530001)

水牛被國際糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)定為最具開發(fā)潛力和開發(fā)價(jià)值的家畜。由于其具有耐粗飼、抗病力強(qiáng)、易飼養(yǎng)等特點(diǎn)而被廣泛飼養(yǎng)。水牛遍及全世界，但主要分為河流型水牛和沼澤型水牛，我國本地水牛主要是沼澤型水牛，一直以來主要用于耕地和產(chǎn)肉。然而，隨著社會的進(jìn)步，機(jī)械化程度的進(jìn)一步提升，水牛的役用價(jià)值逐漸淡出了人們的視野。自1957年開始，我國陸續(xù)從國外引進(jìn)產(chǎn)奶性能高的河流型水牛，以改良本地水牛，中國水牛開始向乳肉兼用型轉(zhuǎn)變，水牛產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展。然而，盡管我國水?，F(xiàn)有存欄量多，但水牛的低繁殖力一直是制約水牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。水牛是單胎動物，正常情況下只有一個(gè)卵泡發(fā)育成熟并排卵；其次，水牛是季節(jié)性發(fā)情動物，發(fā)情癥狀不明顯，且排卵不規(guī)律，這些都大大降低了水牛的繁殖性能。如何提高水牛的繁殖性能，促進(jìn)水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，成為了廣大畜牧科研工作者和生產(chǎn)者亟需解決的問題。目前，有關(guān)水牛繁殖性能的研究主要是利用現(xiàn)代動物繁殖新技術(shù)，包括人工授精、超數(shù)排卵、體外胚胎生產(chǎn)、胚胎移植等技術(shù)手段，但其存在遺傳進(jìn)展慢，手段繁瑣、成本高等問題。而隨著分子遺傳學(xué)和分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)與繁殖性狀密切相關(guān)，可作為繁殖性狀分子標(biāo)記基因，在育種時(shí)可對其進(jìn)行早期選擇，從而節(jié)省成本。因此這也成為了提高水牛繁殖性能的一種新途徑。但是，目前與繁殖性狀相關(guān)基因的研究報(bào)道多集中于奶牛和肉牛，在水牛上的研究進(jìn)展仍相對緩慢，故研究人員大多是參考已經(jīng)報(bào)道與奶牛、肉牛等繁殖性能有關(guān)的基因，并以此作為候選基因來研究對水牛繁殖性能的影響。本文主要從基因分子水平上概述近年來水牛繁殖性狀相關(guān)基因的研究進(jìn)展，為從基因水平提高水牛繁殖效率提供理論依據(jù)。

1 水牛繁殖性狀相關(guān)基因

1.1 生長分化因子9(GDF-9)

GDF-9是由卵母細(xì)胞分泌的一種生長因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員。主要通過調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過程進(jìn)而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟。該基因可作為動物繁殖性狀的候選基因。Yutaka等[1]研究表明，在牛早期胚胎發(fā)育過程中，對GDF-9基因的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，GDF-9基因從胚胎發(fā)育起始直到八細(xì)胞期一直處于高表達(dá)，但是到了囊胚期就消失，說明GDF-9基因能促進(jìn)牛早期胚胎發(fā)育。Spicer[2]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-9基因能有效刺激牛小腔卵泡到排卵前卵泡顆粒細(xì)胞增殖，促進(jìn)卵丘的擴(kuò)展，并阻止生長卵泡的顆粒細(xì)胞過早分化。張路培等[3]對魯西牛GDF-9基因多態(tài)位點(diǎn)與雙胎性狀的研究發(fā)現(xiàn)，該基因的3′UTR發(fā)生缺失突變，導(dǎo)致該多態(tài)位點(diǎn)與單胎群體和雙胎群體基因型分布有極顯著差異，雙胎牛群體的B等位基因頻率明顯大于單胎牛群體。在水牛早期報(bào)道中，劉金鳳等[4]、馮萬友[5]對水牛GDF-9基因進(jìn)行了克隆及表達(dá)分析，結(jié)果顯示，水牛GDF-9的全長CDS為1 362 bp，與奶牛序列相似性為98%；蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，在氨基酸389AA-449AA(GDF-9)位點(diǎn)間具有保守的TGF-β功能域。陳亮等[6]對檳榔江水牛及德宏水牛GDF-9基因多態(tài)性與繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，GDF-9基因多態(tài)性豐富，多個(gè)變異位點(diǎn)均與檳榔江水牛和德宏水牛的繁殖性狀具有顯著或極顯著的關(guān)系，提示GDF-9基因變異可能是導(dǎo)致水牛繁殖性能差異的重要基因。

1.2 促卵泡素激素β亞基基因(FSH-β)

促卵泡素(FSH)是由垂體前葉合成的糖蛋白類激素，其靶腺是卵巢，對哺乳動物卵泡發(fā)育、成熟以及排卵有重要作用。哺乳動物的FSH分子結(jié)構(gòu)由α、β 2個(gè)亞基組成，其中α亞基負(fù)責(zé)信號傳導(dǎo)作用，β亞基是具有特異作用的功能亞基且參與受體結(jié)構(gòu)并決定促卵泡素的特異性。FSH-β基因在豬上的研究較多，趙要風(fēng)等[7]研究認(rèn)為，F(xiàn)SH-β基因座位是控制豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的主效基因，可能與豬高產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)。但FSH-β亞基在牛上相對比較保守，變異比較簡單。陳寶劍等[8]對廣西沼澤型水牛FSH-β亞基進(jìn)行克隆和序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因的cDNA序列與印度水牛的cDNA序列同源性為99%，其中有3個(gè)位置發(fā)生了堿基的突變，但并未引起氨基酸的突變。宋敏艷等[9]分析德宏水牛及雜交后代FSH-β基因多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有23個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率在繁殖良好和繁殖異常兩個(gè)群體中存在差異，說明FSH-β基因在德宏水牛及雜交后代具有很高的基因變異性，可能是影響水牛繁殖性能的一個(gè)主要基因。

1.3 卵泡抑素基因(Follistatin，F(xiàn)ST)

卵泡抑素最早是從牛和豬的卵泡液中分離出的一種富含半胱氨酸的糖基化單鏈多肽，對卵泡刺激素具有較強(qiáng)的抑制作用，因此又稱為卵泡刺激素抑制蛋白(FSP)。它是卵巢卵泡內(nèi)重要的局部調(diào)節(jié)因子，對卵母細(xì)胞及胚胎的成熟發(fā)育具有重要的促進(jìn)作用[10-14]。董平[15]研究表明，卵泡抑素是通過影響顆粒細(xì)胞中抑制素和活化素受體的活動，調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞周期并且抑制細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響細(xì)胞類固醇激素的分泌，說明了卵泡抑素對顆粒細(xì)胞具有直接調(diào)控的作用。郭鎮(zhèn)華[16]、王春強(qiáng)等[17]研究表明，適宜FST濃度可顯著提高牛受精卵的總卵裂率。而在水牛的早期報(bào)道中，鄧?yán)^賢[18]對FST基因進(jìn)行了cDNA克隆及真核表達(dá)，結(jié)果顯示，F(xiàn)ST基因cDNA序列全長1 035 bp，與奶牛的序列同源性達(dá)到98.8%，且有12處堿基發(fā)生了突變，其中+389和+469位兩處堿基的變化引起了氨基酸的改變。隨后，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)李素霞等[19]分析了FST基因在檳榔江、德宏水牛中的多態(tài)性，并與繁殖性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明，在檳榔江、德宏水牛的FST基因序列中共檢測到7個(gè)SNP位點(diǎn)，其中有2個(gè)變異位點(diǎn)與產(chǎn)犢率呈極顯著相關(guān)。

1.4 輔肌動蛋白1基因(α-actinin1)

輔肌動蛋白1基因(α-actinin1)是存在spectrin蛋白超家族的肌動蛋白交聯(lián)劑[17]，它通過綁定到肌動蛋白并且和肌動蛋白發(fā)生關(guān)聯(lián)而起作用。相關(guān)研究表明，α-actinin1基因與產(chǎn)犢數(shù)和精液品質(zhì)密切相關(guān)[20]。該蛋白也在精子中表達(dá)并且涉及到頂體反應(yīng)中跨膜變化[21]。近年來，關(guān)于α-actinin1基因也有了報(bào)道，淮亞紅等[20]研究了包括水牛在內(nèi)的多種牛α-actinin1基因的多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明，在α-actinin1基因第13內(nèi)含子的669 bp處存在1個(gè)A/G的突變，產(chǎn)生AA和AG 2種基因型，但結(jié)果顯示A→G的突變對產(chǎn)犢數(shù)沒有顯著影響。同年，作者又對α-actinin1基因進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在內(nèi)含子15和內(nèi)含子10發(fā)生的2處突變，該突變可作為產(chǎn)犢數(shù)性狀候選分子的遺傳標(biāo)記[22-24]。

1.5 其他基因

張小輝[25]研究表明，BMP基因家族可能與牛的產(chǎn)犢數(shù)有關(guān)。Lei等[26]報(bào)道，BMP1可能通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡來促進(jìn)水牛卵泡的選擇和優(yōu)勢化，添加BMP1重組蛋白會引起顆粒細(xì)胞關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)上調(diào)。El-Bayomi等[27]研究表明，CYP19A1基因表達(dá)降低可能會提高卵巢氧化性損害的發(fā)生率，影響雌水牛的繁殖效率。Wang等[28]通過連鎖不平衡分析鑒定出3個(gè)單倍型，合并基因型H1H2和H1H3的水牛射精量較多，且GnRHR中18 953 bp處的GGCAAAGTAA缺失與較多射精量顯著相關(guān)。同樣，Cheng等[29]鑒定出4個(gè)單倍型，其中基因型為H2H2的水牛射精量較多，單體型為H1H4的水牛精子密度較高。魏武川等[30]研究發(fā)現(xiàn)FSHR與牛的繁殖性狀存在連鎖相關(guān)。雷雪芹等[31]發(fā)現(xiàn)FSHR基因第10外顯子的多態(tài)性與牛的雙胎性狀有著明顯的相關(guān)關(guān)系。屈春鳳等[32]研究表明，AQP9基因在水牛卵巢和睪丸中的表達(dá)及其功能可能與水牛卵泡發(fā)育和精子發(fā)生有重要的關(guān)聯(lián)。劉晨等[33]研究表明，AQP9基因主要參與早期卵泡閉鎖的過程，該基因可能通過PKC信號通路調(diào)節(jié)水牛顆粒細(xì)胞的凋亡。

2 水牛繁殖性狀相關(guān)的全基因組研究

近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展以及大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用到牛、豬和雞等畜禽育種領(lǐng)域，特別是針對畜禽經(jīng)濟(jì)性狀，獲得了顯著成效。大量的與繁殖、泌乳、疾病和生長相關(guān)的候選基因被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，極大地促進(jìn)了畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳解析。

Camargo等[34]利用90 K基因芯片對摩拉水牛的繁殖性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定出多個(gè)候選基因，其中TPCN1基因與產(chǎn)犢間隔有關(guān)，它能夠參與精子的頂體反應(yīng)[35]；另一個(gè)候選基因SELP與第1次產(chǎn)犢日齡有關(guān)，在卵泡閉鎖過程中表達(dá)量上升[36]；該基因可能通過表達(dá)水平的改變調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達(dá)豐度，從而影響母畜受孕[37]。此外，還鑒定到候選基因ABCC4，該基因與配種次數(shù)密切相關(guān)。有研究表明，ABCC4基因在妊娠牛和豬的子宮內(nèi)膜中表達(dá)量上升，對妊娠的維持非常重要[38-39]。Wu等[40]利用50 K基因芯片對廣西雜交水牛進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定到與水牛繁殖性狀相關(guān)的2個(gè)候選基因，其中ARID4B基因與早期胚胎發(fā)育過程中性別分化有關(guān)[41]。另一個(gè)候選基因CADM2上游的1個(gè)SNP位點(diǎn)與水牛的第1次產(chǎn)犢和第2次產(chǎn)犢間隔相關(guān)。李俊[42]利用90 K基因芯片對意大利水牛進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析時(shí)，檢測到CADM2基因下游的1個(gè)SNP位點(diǎn)與第2次產(chǎn)犢日齡相關(guān)。說明這2個(gè)CADM2基因附近的SNP可能是通過與其他關(guān)鍵的SNP或候選基因協(xié)調(diào)互作影響水牛的繁殖性能。此外，還檢測到1個(gè)重要的候選基因IGFBP7，即胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7，該基因最初被認(rèn)為是FSH分泌的抑制劑，對卵泡發(fā)育和卵巢功能起著至關(guān)重要的作用[43-49]。該基因和卵泡抑素具有高度的序列同源性[42]。其可能是通過參與調(diào)控卵泡發(fā)育和排卵，最終影響水牛的繁殖性能。

3 小結(jié)與展望

水牛的繁殖性能在水牛的遺傳改良中有著非常重要的地位。開展水牛繁殖性能相關(guān)基因的研究，一方面有助于品種資源的保護(hù)，另一方面有助于培育高繁水牛新品種。水牛繁殖性狀遺傳力低，且影響因素多，單純的依靠現(xiàn)代繁殖新技術(shù)和常規(guī)育種方法進(jìn)行遺傳改良，不僅耗費(fèi)時(shí)間長，效果也微弱。而隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和基因組時(shí)代的到來，利用分子標(biāo)記輔助選擇和基因組選擇手段被認(rèn)為是提高水牛繁殖性能的一種有效途徑。尤其在當(dāng)下，國家提出“農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化，種子是基礎(chǔ)”的口號。水牛作為我國南方重要的物種資源，我們不僅要保好種，還要進(jìn)行有效的遺傳改良，讓水牛產(chǎn)出更多的肉和奶，以滿足廣大人民的需求。因此，對于快速提高水牛最重要的兩個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀，即水牛繁殖性狀和產(chǎn)奶性狀來說，分子標(biāo)記輔助選擇和基因組選擇將是未來水牛乃至其他動物育種的一個(gè)趨勢。