陳宏彬，鄢育青， 張炎華，林 琦，吳晶晶，修文瓊

流行性感冒(Influenza)簡稱流感，是流感病毒引起的一種急性發(fā)熱性呼吸道傳染病。流感病毒是RNA病毒，病毒顆粒的表面有兩種形態(tài)不一、長度均為10～20 nm的糖蛋白突起，即血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Iveuramidinase,NA)，均具有抗原性。HA及NA易于發(fā)生變異，而且變異是各自獨立的。HA是病毒的主要抗原,不僅與機體免疫密切相關(guān),而且還是流感發(fā)生抗原性變異的分子基礎(chǔ)。疫苗接種是預(yù)防流感病毒感染的最佳方法，但抗原性不同、分離株的多樣性給疫苗開發(fā)帶來持續(xù)挑戰(zhàn)[1]。2009年5月23日福建省出現(xiàn)首例輸入性甲型H1N1流感確診病例，該病例分離毒株與北美流行株高度同源[2]。此后，A(H1N1)pdm09亞型在福建省流感占據(jù)了重要的一部分。流感病毒通過人際傳播引起了世界大流行嚴重威脅人類健康，造成巨大經(jīng)濟負擔。本研究通過分析2016-2020年福建省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒的HA基因特征，了解病毒的進化與變異趨勢，為制定流感流行防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 資料及標本來源 中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)采集日期2016年1月1日至2020年12月31日的福建省流感監(jiān)測數(shù)據(jù)。毒株來源2016-2020年福建省流感網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測流感樣病例，犬腎傳代細胞或雞胚分離培養(yǎng)。2016-2019年選取不同時間地區(qū)各12株、2020年毒株數(shù)量較少僅4株，總共52株。

1.2 病毒核酸的提取 天隆科技(蘇州)有限公司病毒RNA提取試劑盒，按說明書操作提取病毒RNA。

1.3 引物設(shè)計與合成 引物序列見表1，由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

表1 A(H1N1)pdm09型流感病毒HA基因擴增引物Tab.1 HA gene amplification primers for the influenza A (H1N1) pdm09 virus

1.4 RT-PCR擴增及測序 SuperScript III One-step RT PCR System with platinum Taq High Fidelity DNA Polymerase (Invitrogen)試劑盒。反應(yīng)程序：45 ℃ 60 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，44 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，5 cycles；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，31 cycles；68 ℃ 7 min。產(chǎn)物測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.5 序列分析及進化樹 2016-2020年福建省流感毒株序列用CLC軟件拼接。與WHO推薦的北半球流感疫苗株2016-2017：A/California/07/2009、2017-2018：A/Michigan/45/2015、2018-2019：A/Michigan/45/2015、2019-2020：A/Brisbane/02/2018、2020-2021：A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019和clade代表株(參考https://www.ecdc.europa.eu/en)以及GISAID或GenBank下載的國內(nèi)不同年份不同省份毒株117株，國外各地不同年份不同地區(qū)毒株83株共266株進行多序列排列比對。MEGA5構(gòu)建Maximum Likelihood進化樹，JTT-model, Bootstrap Reps 為1 000。

1.6 基因位點特征分析 福建省毒株與當年WHO推薦的北半球流感疫苗株對比分析抗原決定簇、受體結(jié)合位點差異。Net NGlyc 1.0 Server在線分析軟件預(yù)測糖基化位點。

2 結(jié) 果

2.1 2016-2020年福建省流感流行情況分析 2016-2020年福建省流感網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測流感樣病例原始標本PCR鑒定結(jié)果詳見圖1。2016-2020年福建省不同年份不同型別流感病例數(shù)相差較大。2020年福建省流感病例總數(shù)為5年來最低。福建省近5年來H1N1pdm09在每一年都有流行，在2018年病例數(shù)最多，在2020年最少。

2.2 進化樹分析 福建省52株與疫苗株4株以及國內(nèi)不同年份不同省份毒株117株、國外各地不同年份不同地區(qū)毒株83株共266株進化樹見圖2。2016年福建省毒株分為2支，一支為6B，一支為6B.1。2017年毒株分布泛，所占分支多。2018年和2019年一部分毒株分支有交集，分支較多分散涉及6B.1A2、6B.1A3等分支，仍在6B.1分支內(nèi)。2019年一部分毒株與2020年為6B.1A5A。相鄰年份毒株分支會有一定重疊，每年份毒株不止一個分支，可見3個年份毒株在同一分支里。我省毒株與其他省份、國外毒株分布基本一致，但仍有個別不同。縱觀進化樹每年WHO推薦疫苗株基本與主流行毒株一致。

2.3 抗原決定簇及受體結(jié)合位點 與A/California/07/2009(H1N1) 比較福建省毒株抗原決定簇變異位點[3]和受體結(jié)合位點[4](表2)。主要涉及到Sa抗原決定簇，并穩(wěn)定遺傳從2016年直至2020年。其次為Ca抗原決定簇、Sb抗原決定簇，并涉及到多個受體結(jié)合位點(Receptor binding site，Rbs)。Cb決定簇S74R位點在2016年均保守，變異首先出現(xiàn)在2017年的少數(shù)毒株(3/12)，而在2018-2020毒株27株只有2株沒有這個位點變異。與A/California/07/2009相比福建省毒株(總共52株)在抗原決定簇和受體結(jié)合位點外仍有多數(shù)變異位點存在，如：P83S(52株)、S84N(50株)、D97N(52株)、I216T(50株)、A256T(51株)、K283E(52株)、I321V(50株)、E374K(52株)、S451N(52株)、E499K(52株)，這幾個變異位點在福建省毒株及疫苗株幾乎都存在。N129D、D187A/V、Q189E、N260D是2019年開始部分毒株出現(xiàn)，2020年毒株都有的變異位點。

2.4 糖基化位點 2016年疫苗株為8個糖基化位點，福建省毒株有2株為8個糖基化位點，其余10株為9個。2017-2018年疫苗株為9個糖基化位點，2017、2018年福建省毒株各有1株為8個，其余11株各為9個。2019-2020年疫苗株及福建省毒株均為9個糖基化位點。在2017-2018年期間162糖基化位點由NQSY轉(zhuǎn)變?yōu)镹QTY。2018-2019年期間11糖基化位點有3株為NSTE，其余為NSTD。10、23、87、276、287、540糖基化位點未發(fā)生改變。481糖基化位點1株缺失，1株為NETY,54株為NGTY,差異較小。162糖基化位點變異較大，見表3。

圖2 2016-2020年福建省A型H1N1pdm09 流感病毒HA基因進化樹Fig.2 Evolution of the HA gene of influenza A (H1N1) pdm09 virus in Fujian Province from 2016 to 2020

表2 2016-2020年福建省A(H1N1)pdm09 流感病毒HA基因變異情況Tab.2 Variations in the HA gene in influenza A (H1N1) pdm09 in Fujian Province from 2016 to 2020

表3 2016-2020年福建省A(H1N1)pdm09 流感病毒HA基因糖基化位點變異情況Tab.3 Variations in glycosylation sites of the HA gene of influenza A (H1N1) pdm09 virus in Fujian Province from 2016 to 2020

3 討 論

流行性感冒是一種全球性的健康問題，在人類、豬和其他各種哺乳動物和禽類中引起很高的發(fā)病率和死亡率。臨床上預(yù)防和治療流感的手段主要有疫苗和抗流感藥物。流感病毒具有極強的重組變異和抗原漂移能力，嚴重限制了流感疫苗的免疫保護作用。RNA病毒有可能在短時間內(nèi)產(chǎn)生遺傳變異。病毒的基因重組是導(dǎo)致高致死率的嚴重人類大流行的主要因素之一。非復(fù)制型疫苗引起的免疫反應(yīng)主要針對流感病毒的血凝素成分[5]。

2016年歐盟/歐洲經(jīng)濟區(qū)(EU/EEA)流感94%流行型別為A型[6]，2018-2019年EU/EEA最主要流行型別為A型，僅極少數(shù)為B型[7]，2020-2021年ED/EEA地區(qū)流感活躍度降低，主要型別為B型[8]。2016福建省A型/B型各占半數(shù)，2018-2019雖仍以A型主導(dǎo)，但B型數(shù)量也不少。2020年福建省流感各型別數(shù)量急劇下降(圖1),主要由于為減少SARS-CoV-2傳播而采取的各種公共衛(wèi)生和社會措施(如停止全球旅行、口罩使用、保持距離、居家)的影響。美國流感活躍度在2020年3月下降，在2020年夏季期間處于歷史低位，并在2020年10月至2021年5月期間保持低位[9]。因此對于不同地區(qū)疫苗株匹配度也會有差異。同樣情況也存在于甲型 H3N2，有研究[10]表明H3N2的亞型存在多樣性， 多種亞型共存且不同年份間的優(yōu)勢流行株存在差異。

全球流感毒株在2016年開始發(fā)生較大轉(zhuǎn)變，分支由6B轉(zhuǎn)化為6B.1并演化至6B.1A5A。2019-2020年歐洲CDC(eCDC)報告A(H1N1)pdm09主要為6B.1A5A分支[11]，與福建省及其他省流行株所在分支相同，但仍有少數(shù)毒株不在此分支內(nèi)。2009-2013年期間因6B/6B.1/6B.2感染而導(dǎo)致發(fā)生流感相關(guān)并發(fā)癥肺炎、機械通氣和急性呼吸窘迫綜合征的風險較高，2015-2016幾個歐洲國家報告了高危群體和健康青年中大量的嚴重病例和結(jié)果[12]。不同年齡組在大流行病毒時暴露的免疫史可能是一個因素，原始抗原原罪的概念為不尋常的死亡模式提供了解釋,年輕人肺部的細胞因子風暴的出現(xiàn)或消失也可能與此有關(guān)[13]。流感不同型別交叉復(fù)雜的流行情況使防控難度增加。

5年來，福建省H1N1pdm 09 在多個抗原決定簇及受體結(jié)合位點，糖基化位點均有發(fā)生改變，并且在其他一些非抗原決定簇位點也發(fā)生較多改變。福建省毒株變異位點S162N是抗原決定簇也是糖基化位點。復(fù)合功能位點的改變必然對毒株毒力產(chǎn)生較大影響。HA糖基化位點的增減及位置變化，HA上糖鏈結(jié)構(gòu)、數(shù)量的變化以及受體結(jié)合位點附近糖鏈的修飾等不僅對病毒的增殖、毒力產(chǎn)生影響，還會影響病毒與宿主細胞受體的結(jié)合能力等[14]。近年來，基于表位選擇的多表位疫苗受到越來越多的研究,為了避免對疫苗效果的不合理預(yù)測，必須從分子和細胞層面進行多階段生物信息學分析[15]。福建省在其他一些非抗原決定簇位點也發(fā)生較多改變。對于抗原決定簇外位點也有可能協(xié)同病毒表面的不同位點一起產(chǎn)生不同的結(jié)合力影響與抗體或體內(nèi)其他細胞因子的結(jié)合，如涉及到一些B細胞、CTL、CD4T細胞上的表位[15]。

2009-2014年福建省隨著時間的推移HA 基因進化樹逐漸形成6個分支，在同一年份里也有毒株位于不同的分支內(nèi)[16]。在甲型H1N1流感期間，pdm09演化支6B/6B.1/6B.1A5A的感染嚴重程度增加A(H1N1)pdm09病毒的抗原變化、宿主的免疫應(yīng)答、環(huán)境因素需要進一步調(diào)查。鑒于疫苗的有效期、人群的低接種率，國際貿(mào)易人和物品流通增強、國家人口基數(shù)較大需加強對流感的監(jiān)測及功能研究以預(yù)防和控制疾病傳染。根據(jù)進化樹時間分布病毒流行株具有遺傳多樣性，單一年份疫苗株的有效性值得推敲。對于沒有每年注射流感疫苗的人來說，預(yù)防感染效果可能達不到。

流感病毒真正的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程還有待進一步研究，理論和觀察到的實驗現(xiàn)象之間并不完全相符[17]。目前流感疫苗的生產(chǎn)還是以雞胚苗為主,問題仍然在于候選疫苗株的篩選方面，認為應(yīng)在雞胚苗的基礎(chǔ)上改善季節(jié)性流感疫苗疫苗株的篩選[18]。本文分析2016-2020年間福建省H1N1pdm 09 毒株HA 基因的變異情況，并了解福建省與其他省份和全球范圍內(nèi)流感時間和空間上的分布差異，為我們更準確地了解流感病毒的傳播周期、范圍和以此為基礎(chǔ)的抗流感藥物的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無

引用本文格式：陳宏彬，鄢育青，張炎華，等. 2016-2020年福建省A(H1N1)pdm09流感病毒HA基因特征分析[J].中國人獸共患病學報，2022，38(11)：988-995. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.144