聶守民，羅波艷，孫養(yǎng)信，范鎖平，王文靜，周地佳，孫 杰，常文輝，安翠紅

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌屬(Brucella)細(xì)菌感染而引起的可在全世界范圍內(nèi)發(fā)生流行的、人獸共患的一種自然疫源性的傳染性疾病，簡稱為布病[1]。人主要是通過直接接觸受布魯氏菌感染的病畜及其分泌物或病畜的肉、奶、皮毛等加工品經(jīng)消化道、呼吸道、破損的皮膚黏膜等方式而被感染，感染以后會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛等臨床癥狀[2]；動(dòng)物主要是通過交配或接觸被布魯氏菌感染的病畜污染的環(huán)境和飼料等經(jīng)消化道、呼吸道、破損的皮膚黏膜等方式而被感染，感染以后會(huì)出現(xiàn)孕畜流產(chǎn)、公畜睪丸炎、跛行等臨床表現(xiàn)[3]。人間布病是我國法定的乙類傳染病，畜間布病是我國法定的多種動(dòng)物共患的二類動(dòng)物疫病[4]。布病不僅嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展，阻礙社會(huì)經(jīng)濟(jì)的增長，更是危害人民群眾身體健康、社會(huì)持續(xù)性穩(wěn)定及公共衛(wèi)生安全的重大威脅[5]。

2020年3月，陜西省咸陽市三原縣發(fā)生一起人間布魯氏菌病家庭聚集性疫情，本實(shí)驗(yàn)室在2名患者血液內(nèi)分離到2株布魯氏菌，利用MLVA16方法進(jìn)行分型鑒定，為陜西省內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的新基因型。

1 材料與方法

1.1 流行病學(xué)調(diào)查 對2名患者進(jìn)行個(gè)案調(diào)查，每位患者采集2份靜脈血，用于虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)及雙相血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

1.2 儀器設(shè)備 生物安全柜(賽默飛世爾科技公司)，恒溫生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，金屬浴(杭州米歐儀器有限公司)，高速離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)，PCR擴(kuò)增儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)，水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，凝膠成像儀(美國伯樂公司)，ABI3730測序儀(賽默飛世爾科技公司)，立式蒸汽高壓滅菌鍋(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)。

1.3 試劑耗材 虎紅平板凝集抗原(蘭州生物所)，試管凝集抗原(蘭州生物所)，雙相血培養(yǎng)瓶(貝瑞特生物技術(shù)(鄭州)有限責(zé)任公司)，單項(xiàng)特異性血清A、M(青島中創(chuàng)匯科生物科技有限公司)，菌種保藏管(上海寶錄生物科技有限公司)，細(xì)菌核酸提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，超純水(北京索萊寶科技有限公司)，2×PCR擴(kuò)增混合液(2 × TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司西安分公司)，PCR用管(上海百賽生物技術(shù)股份有限公司)，瓊脂糖(賽默飛世爾科技公司)，5×TBE電泳緩沖液(賽默飛世爾科技公司)，DNA染料(賽默飛世爾科技公司)，DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)室檢測方法

1.4.1 血清學(xué)檢測 采用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)初篩，試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)確診，按照國家布病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，血清滴度≥1∶100(++)為陽性結(jié)果。

1.4.2 病原學(xué)檢測 取患者5～10 mL靜脈血無菌注射到雙相血培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置在37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間為7～21 d。出菌后安全轉(zhuǎn)移至三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，在生物安全柜內(nèi)用接種環(huán)挑取菌落至培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行純化培養(yǎng)。利用單項(xiàng)特異性血清A、M凝集試驗(yàn)進(jìn)行菌株種型鑒定。

1.4.3 核酸檢測 在生物安全柜內(nèi)用10 μL接種環(huán)挑取半環(huán)純菌至提前加有300 μL超純水的Ep管中混勻，放置在金屬浴中80 ℃持續(xù)30 min。按照細(xì)菌核酸提取試劑盒操作說明進(jìn)行核酸提取。采用BCSP31-PCR從菌屬水平上對菌株進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增出223 bp目的片段即為布魯氏菌屬；采用AMOS-PCR從菌種水平上對菌株進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增出731 bp目的片段即為羊種布魯氏菌(羊種1型、羊種2型或羊種3型)。引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序均參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。分離菌株種型鑒定要根據(jù)單項(xiàng)特異性血清A、M凝集結(jié)果及核酸檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判定。

1.5 分子分型

1.5.1 多位點(diǎn)序列分析(multilocus sequence typing，MLST) MLST方法選擇9個(gè)布魯氏菌基因片段(gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ、int-hyp、omp25)作為靶標(biāo)基因。9對引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序均參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司西安分公司進(jìn)行雙向測序，通過比對序列，獲得分離菌株的基因序列型及MLST基因型。

1.5.2 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multi-variable-number tandem repeat analysis，MLVA) MLVA通過16個(gè)基因位點(diǎn)對分離菌株進(jìn)行分型。16對引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序均參照文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物長度檢測，通過比對片段長度得到串聯(lián)重復(fù)數(shù)。登錄MLVAbank for Microbes Genotyping (https://microbesgenotyping.i2bc.paris-saclay.fr/)，將所得串聯(lián)重復(fù)數(shù)與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而確定分離菌株的MLVA基因型。

1.5.3 聚類分析 用Excel匯總本研究分離菌株與陜西省其他分離菌株、國內(nèi)外部分參考菌株的MLST分型數(shù)、MLVA16分型數(shù)，利用BioNumerics(Version7.6)軟件，通過UPGMA(平均連鎖聚類法)對分離菌株進(jìn)行聚類分析，用最小生成樹(Minimum spanning tree)進(jìn)行高級(jí)聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 疫情概況 首發(fā)病例趙某，男，48歲，陜西省咸陽市三原縣人，農(nóng)民，主要從事奶羊養(yǎng)殖工作。患者自述2020年2月26日出現(xiàn)乏力癥狀，3月2日出現(xiàn)膝蓋疼痛癥狀并伴有發(fā)熱，體溫38.5 ℃，自行服用酚氨咖敏膠囊后癥狀緩解，3 d后發(fā)熱反復(fù)，自覺乏力及膝關(guān)節(jié)疼痛；患者李某，女，49歲，為首發(fā)病例趙某的妻子，農(nóng)民，主要從事奶羊養(yǎng)殖工作。患者自述于3月15日出現(xiàn)乏力癥狀病伴有指關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)輕微疼痛。3月27日，2人一同前往醫(yī)院就診，診斷為布魯氏菌病。通過流行病學(xué)調(diào)查得知趙某家有2只奶羊于2020年1月15日出現(xiàn)流產(chǎn)，夫妻2人在處理流產(chǎn)物時(shí)未采取有效防護(hù)措施?；颊邔Σ剪斒暇〉闹獣猿潭炔桓?，在日常的養(yǎng)殖過程中不注重個(gè)人防護(hù)，奶羊圈養(yǎng)環(huán)境較差。

確診后隨即對兩名患者建立了治療檔案并定期進(jìn)行隨訪，督促患者足量、足療程用藥，同時(shí)對患者居家環(huán)境及奶羊圈養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行了終末消毒，對病例同村村民進(jìn)行了布病防治知識(shí)宣傳。由于患者確診及時(shí)，尚處在布魯氏菌病急性期，現(xiàn)已痊愈。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果

2.2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果 夫妻2人虎紅平板凝集初篩試驗(yàn)和試管凝集確診試驗(yàn)結(jié)果均為陽性：趙某為1∶400(+++)，李某為1∶200(++)。

2.2.2 病原學(xué)檢測結(jié)果 2020年3月27日采集夫妻2人血液進(jìn)行培養(yǎng)，趙某的雙相血培養(yǎng)瓶于4月2日出現(xiàn)菌落，編號(hào)為SN2020.2；李某的培養(yǎng)瓶于4月3日出現(xiàn)菌落，編號(hào)為SN2020.4。經(jīng)單相特異性A、M血清凝集試驗(yàn)，2株分離菌株的結(jié)果均為A不凝集，M凝集(A-，M+)。該結(jié)果表示分離菌株可能是羊種1型布魯氏菌或牛種4、5、9型布魯氏菌。

2.2.3 核酸檢測結(jié)果 2株分離菌株的核酸經(jīng)BCSP31-PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)223 bp的片段，證明分離菌株屬于布魯氏菌屬；經(jīng)AMOS-PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)731 bp的片段，證明分離菌株是羊種布魯氏菌，結(jié)合A、M血清凝集試驗(yàn)結(jié)果，判定2株分離菌株為羊種1型布魯氏菌。

2.3 MLST結(jié)果 2株分離菌株MLST9個(gè)位點(diǎn)gap-aroA-glk-dnaK-gyrB-trpE-cobQ-(int-hyp)-omp25的序列號(hào)為3-2-3-2-1-5-3-2-8，MLST基因型確定為ST8，與陜西省分離菌株的ST型相同。

2.4 MLVA結(jié)果 2株分離菌株的16個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)Bruce06-Bruce08-Bruce11-Bruce12-Bruce42-Bruce43-Bruce45-Bruce55-Bruce18-Bruce19-Bruce21-Bruce04-Bruce07-Bruce09-Bruce16-Bruce30的基因型為1-5-3-8-2-2-3-2-4-41-8-4-4-3-5-5。分析發(fā)現(xiàn)，該基因型在12位點(diǎn)VNTR結(jié)果為8，與陜西省其他菌株(結(jié)果為13)不一致。通過查詢布魯氏菌的MLVA數(shù)據(jù)庫，該2株分離菌株的基因型為首次發(fā)現(xiàn)，panel 1基因型命名為8-N1型，MLVA11基因型命名為11-N1型[11]。

2.5 聚類分析結(jié)果 MLST聚類分析見圖1，MLVA聚類分析見圖2，MLVA高級(jí)聚類分析的最小生成樹見圖3。

3 討 論

布魯氏菌病是我國法定的乙類傳染病，同時(shí)也是法定的二類動(dòng)物疫病。傳染源一般在畜間，如果不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)很容易造成人間布病疫情的發(fā)生。布魯氏菌病的病死率很低，但是急性期如果未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷和治療，將會(huì)轉(zhuǎn)變成遷延不愈的慢性布魯氏菌病，會(huì)嚴(yán)重危害患者的身心健康并造成非必要的經(jīng)濟(jì)損失。畜間布魯氏菌病發(fā)生會(huì)阻礙畜牧業(yè)及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的良好發(fā)展，同時(shí)也是對公共衛(wèi)生安全的一種威脅。因此，要加強(qiáng)對布魯氏菌病的監(jiān)測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)報(bào)告病例，盡早控制疫情的蔓延。

三原縣隸屬于陜西省咸陽市，位于關(guān)中平原中部，是咸陽市大力發(fā)展千億級(jí)奶山羊產(chǎn)業(yè)鏈的主要縣(區(qū))之一。隨著奶山羊養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，散養(yǎng)戶數(shù)量及羊只存欄量急劇上升，畜間及人間布魯氏菌病的防控壓力增大。三原縣東與臨潼、富平、閻良相接，西與涇陽、淳化相連，北與耀州相鄰，南與高陵相靠，四周接壤的都是布病高發(fā)的縣區(qū)，因患病羊只的肆意流動(dòng)導(dǎo)致布魯氏菌病疫情的風(fēng)險(xiǎn)增大。本次家庭聚集性疫情就是由于奶羊散養(yǎng)戶在日常養(yǎng)殖過程中及處理流產(chǎn)物時(shí)沒有采取有效個(gè)人防護(hù)造成的，散養(yǎng)戶作為布魯氏菌病的高危人群缺乏對該傳染病的知曉，在今后的防控工作中應(yīng)該加強(qiáng)對高危人群的健康教育工作，大力普及布魯氏菌病的防治知識(shí)，增強(qiáng)散養(yǎng)戶等高危人群的防護(hù)意識(shí)。

虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)和試管凝集試驗(yàn)(SAT)在基層使用廣泛，能夠?yàn)榕R床診斷提供支持，對布魯氏菌病疫情的早發(fā)現(xiàn)具有重要的意義。本次疫情分離得到的兩株布魯氏菌經(jīng)血清凝集實(shí)驗(yàn)及核酸檢測鑒定為羊種1型，而陜西省多年來流行的主要種型為羊種3型，結(jié)合患者臨床癥狀及流行病學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)兩種不同型別的羊種布魯氏菌引起的疫情有所區(qū)別，但陜西省多年來未有關(guān)于羊種1型布魯氏菌疫情的報(bào)道，所以本次疫情值得進(jìn)一步研究分析。

圖1 MLST聚類分析圖Fig.1 MLST cluster analysis diagram

注：框選部分為本次疫情的分離菌株信息。圖2 MLVA聚類分析圖Fig.2 MLVA cluster analysis diagram

圖3 MLVA分型最小生成樹Fig.3 Minimum spanning tree of MLVA

對分離菌株進(jìn)行分子分型也是一項(xiàng)很重要的工作，能對疫情的判定及流行病學(xué)溯源等提供有力的支持。傳統(tǒng)分型鑒定具有操作繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長、生物安全要求高、易發(fā)生實(shí)驗(yàn)室感染等諸多不足，已經(jīng)不能滿足當(dāng)前布魯氏菌病的防控需要。多位點(diǎn)序列分析(MLST)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)都是基于PCR技術(shù)對細(xì)菌進(jìn)行基因分析的分子生物學(xué)技術(shù)[12-13]，在分子分型方面發(fā)揮越來越重要的作用。三原縣的2株布魯氏菌分離株的MLST結(jié)果顯示與陜西省其他菌株的ST型一致，與新疆、內(nèi)蒙、福建、土耳其分離的羊種3型菌有較近的進(jìn)化關(guān)系，與青海、海南分離的羊種1型菌遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，說明生物型相同的菌株其基因型別可能存在很大的差別。MLVA結(jié)果顯示本次疫情分離得到的菌株基因型為首次發(fā)現(xiàn)，豐富了陜西省布魯氏菌的基因庫；在全國范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)存在與本次疫情分離株基因型近源的菌株；同時(shí)分型結(jié)果還表明不同疫情分離的菌株各自成簇，同一疫情分離的菌株具有同一基因型，說明同一疫情的不同個(gè)體之間存在相同的傳染源。經(jīng)過分子分型研究，結(jié)合流行病學(xué)分析，本次聚集性疫情確定為本地發(fā)生的，但是菌株間的突變進(jìn)化關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。

為做好全省的人間布魯氏菌病的防控工作，建議市級(jí)疾控中心能夠掌握布魯氏菌的分子分型技術(shù)，建立各市的布魯氏菌分子分型數(shù)據(jù)庫。

利益沖突：無

引用本文格式：聶守民，羅波艷，孫養(yǎng)信，等. 一起人間布魯氏菌病聚集性疫情的病原學(xué)確診及基因分型研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：1007-1011. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.154