郝潤蓮，劉錦騰，王大勇，林于今，王妹妹，左世亮，王亞妹，梁 培，

曼氏迭宮絳蟲(Spirometramansoni)是一種人獸共患的寄生蟲，其需要多個(gè)宿主才能完成一個(gè)完整的生活史，終宿主為貓、犬科動(dòng)物，第一中間宿主為劍水蚤；第二中間宿主為蛙類，然而蛇、鳥、豬等多種脊椎動(dòng)物，亦可做其轉(zhuǎn)續(xù)宿主。人可以做為該蟲的第二中間宿主、轉(zhuǎn)續(xù)宿主甚至終宿主[1]。其幼蟲-裂頭蚴(sparganum)可寄生于人體，引起嚴(yán)重的曼氏裂頭蚴病。由于裂頭蚴寄生于人體各個(gè)組織器官，較多見于腦部、眼部和皮下組織。裂頭蚴寄生于腦部能夠引起腦部功能障礙，甚至癱瘓或死亡；裂頭蚴寄生于眼部，可導(dǎo)致失明。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，曼氏裂頭蚴病呈全球性分布，但在東亞和東南亞地區(qū)報(bào)道的病例較多[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國已有數(shù)千例曼氏裂頭蚴病病例報(bào)道[3]，由于臨床診斷方法受限，存在一定數(shù)量的漏診或誤診病例，而未得到真實(shí)統(tǒng)計(jì)報(bào)道。近5年，我國的廣東、吉林、湖南、福建、海南、四川、上海、云南、河南、江蘇等常有病例報(bào)道，其中廣東報(bào)道的病例數(shù)位居榜首[4]。人主要通過下列兩個(gè)途徑感染裂頭蚴：1)主要通過飲用生水誤食劍水蚤或食用生的、半生的青蛙肉或是蛇肉感染裂頭蚴；2)有使用青蛙肉或是蛇肉敷貼創(chuàng)傷口進(jìn)而感染裂頭蚴[5]。

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGDH)是磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶之一，參與磷酸戊糖途徑的第3步反應(yīng)，其主要生理功能是通過調(diào)節(jié)核糖-5-磷酸(R-5-P)和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的生成，在核苷酸和脂質(zhì)的生物合成以及維持氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡中起著至關(guān)重要的作用[6-7]。該酶存在于眾多生物體中，包括細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中都存在[8]，參與生物體內(nèi)遞氫體NADPH的產(chǎn)生[9-10]。該酶產(chǎn)生的NADPH主要參與氨基酸、脂類及核苷酸等細(xì)胞組成物質(zhì)的合成。有研究通過對家蠶微孢子蟲中的6PGDH進(jìn)行的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該分子參與了微孢子蟲的增殖發(fā)育過程[11]。

曼氏裂頭蚴寄生于中間宿主體內(nèi)，青蛙的肌肉中、人體腦部、人體眼部和皮下等，蟲體維持自身的生存必須從宿主細(xì)胞中獲得大量的營養(yǎng)物質(zhì)。目前，國內(nèi)外對于裂頭蚴的糖代謝研究甚少，對其能量供應(yīng)和與宿主之間的營養(yǎng)物質(zhì)交換的研究更是缺乏。本項(xiàng)目從裂頭蚴中提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，從成蟲基因文庫中調(diào)取Sm6PGDH的全長基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對Sm6PGDH進(jìn)行基因的克隆和蛋白的原核表達(dá)，及其在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)裂頭蚴后的轉(zhuǎn)錄水平，為今后研究其生物學(xué)功能，尤其作為潛在價(jià)值的藥物研究靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 序列和菌種 由海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室呂剛教授課題組提供Sm6PGDH全長基因序列。中山大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室贈(zèng)予含有兩個(gè)His標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET-28a(+)。從天根生化科技(北京)有限公司購得大腸埃希菌菌株E.coliDH5α及BL21(DE3)。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨 (Tryptone)、酵母提取物 (Yeast extract)、Trise-Base購自英國OXOID公司；預(yù)染蛋白Marker (protein Marker)、T4-DNA ligase、限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、內(nèi)切酶Hind Ш、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；SYBR Premix Ex TaqTMII購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自美國Sigma公司；DNA Marker(DL2000，DL1500)、TaqDNA聚合酶、Gold View核酸染料購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；氯化鈉、咪唑、脫脂奶粉等化學(xué)試劑購自北京Sloarbio公司；單克隆抗His標(biāo)簽小鼠抗和抗小鼠IgG-HRP抗體購自美國Proteintech Group公司。

1.2 方 法

1.2.1Sm6PGDH全長基因的識別 從曼氏迭宮絳蟲成蟲基因組文庫中調(diào)取Sm6PGDH的全長序列，利用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的ORF Finder在線軟件預(yù)測分析該基因的開放閱讀框(ORF)。通過NCBI網(wǎng)站中的BLASTx程序，將Sm6PGDH核苷酸序列與Gene Bank中的核苷酸序列進(jìn)行同源性的比對分析。

1.2.2Sm6PGDH的生物信息學(xué)分析 利用在線的蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)ExPASy(www.expasy.org/)中的ProtParam分析工具預(yù)測分析Sm6PGDH的理化性質(zhì)，如氨基酸的組成、分子量、等電點(diǎn)等性質(zhì)；利用在線SignalP和SecretomeP-2.0工具分析Sm6PGDH序列中可能存在的分泌信號肽或是否屬于通過非經(jīng)典途徑分泌的蛋白分子；利用在線DictyOGlyc、NetPhos、NetAcet工具：分別預(yù)測Sm6PGDH氨基酸序列中是否存在潛在的o-(α)-GlcNAc糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、N端乙?；稽c(diǎn)。利用Predictprotein在線工具分析Sm6PGDH的二級結(jié)構(gòu)和親水性特征；通過B細(xì)胞線性表位在線分析軟件(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)分析Sm6PGDH中潛在的B細(xì)胞線性表位。

1.2.3Sm6PGDH基因的擴(kuò)增

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)從Sm6PGDH全長基因序列進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成。上游引物：5′-AAGGATCCATGTCAGGCCGAGGGAAT-3′(下劃線部分為BamHⅠ的酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-CGAAGCTTGGTAGTATTTCCGCCGTC-3′(下劃線部分為Hind Ш的酶切位點(diǎn))。

1.2.3.2Sm6PGDH基因的擴(kuò)增及產(chǎn)物的純化回收 從野生青蛙肌肉中分離裂頭蚴，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，再利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，利用上述特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增Sm6PGDH全長基因序列。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：cDNA模板2.0 μL、上游引物2.0 μL、下游引物2.0 μL、PCR Mix(Taq聚合酶混合物)25.0 μL、去離子水(ddH2O)19.0 μL。將上述混合物混勻后，在以下反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 45 s、退火53 ℃ 55 s、延伸72 ℃ 60 s，一共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，再利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物(按照回收試劑盒的說明操作)。

1.2.4Sm6PGDH基因的原核克隆 用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind Ш對回收的PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-28α(+)分別進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系(20 μL)：原核表達(dá)載體或純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL、10×Buffer 2 μL、BamH I 1 μL、Hind Ш 1 μL、ddH2O 10 μL，在37 ℃條件下反應(yīng)1 h。對酶切后的PCR產(chǎn)物與載體pET-28a(+)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用DNA純化試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。連接反應(yīng)體系(20 μL)：純化回收PCR雙酶切產(chǎn)物2 μL、純化回收載體雙酶切產(chǎn)物6 μL、Ligase Buffer 2 μL、T4 DNA ligase 1 μL、ddH2O 9 μL，室溫反應(yīng)2 h得到連接產(chǎn)物。將上述的連接產(chǎn)物20 μL加入E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用熱休克法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將菌種鋪于含有0.1%卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日挑取陽性克隆菌株，送菌液樣本至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.5 重組蛋白的原核表達(dá)和純化 根據(jù)測序結(jié)果將正確克隆的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Sm6PGDH轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)中。利用1 mmol/L IPTG分別在28 ℃、37 ℃條件下進(jìn)行小量誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)0、2、4、5 h取樣1 mL，12 000 r/min離心，取沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳分析，空載體pET-28a(+)為空白對照組。將上述得到的最佳的誘導(dǎo)條件進(jìn)行蛋白的大量誘導(dǎo)，獲得菌液進(jìn)行離心收集菌體，加入5%咪唑混勻后，進(jìn)行超聲破碎，12 000 r/min離心10 min，收集上清，利用鎳離子親和層析柱進(jìn)行蛋白純化，得到的蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 Western blot鑒定 將純化蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳后，將電泳凝膠浸泡于轉(zhuǎn)移液中5 min，PVDF膜依次浸泡于100%甲醇15 s和ddH2O 5 min。在冰水混合物中，100 V恒壓的條件下進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)膜1 h，用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，次日用PBST溶液振蕩洗滌，每次5 min，洗滌5次。加入1∶15 000稀釋的抗-His小鼠單抗(1% BSA-PBS作為稀釋液)，室溫下孵育2 h，PBST漂洗5次，每次5 min；然后加入抗小鼠IgG-HRP抗體(1∶5 000，1% BSA-PBS稀釋)，室溫孵育2 h，PBST漂洗5次，每次5 min；在黑暗環(huán)境下，利用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，觀察記錄并保存結(jié)果。

1.2.7 不同濃度葡萄糖培養(yǎng)裂頭蚴的轉(zhuǎn)錄水平分析 從野生青蛙中分離出裂頭蚴分別利用無糖、低糖(1.0 g/L)、高糖(4.5 g/L)培養(yǎng)裂頭蚴，加入10% FBS和雙抗進(jìn)行體外培養(yǎng)24 h后，收集蟲體，利用RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)體系為(20 μL)：2 μL cDNA模板、正向和反向引物各0.2 μL、PCR Mix 10 μL、去離子水補(bǔ)足。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。Sm6PGDH引物：5′-TGAAGCCTACCATCTTCTCCG-3′、 5′-GACAG-CCTCGTTCCAGACCAC-3′。內(nèi)參基因Actin引物：5′-CATCTACGAGGGTTACGCACTG-3′、 5′-GCTCATCTCCTGCTCAAAGTCC-3′。

2 結(jié) 果

2.1Sm6PGDH基因的核苷酸序列特征Sm6PGDH全長序列中最長的開放閱讀框?yàn)? 476 bp，共含有491個(gè)氨基酸編碼。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)Sm6PGDH基因序列與增殖型裂頭蚴的同源核苷酸序列(Sparganumproliferum，VZI12751.1)一致性為93.15%，與細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，KAH9286725.1)和多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，CDS40863.1)的同源核苷酸序列一致性在75%以上，與人的同源核苷酸序列(Homosapiens，No.P52209)一致性為66.3%，與小鼠的同源核苷酸序列(Musmusculus, No.Q9DCD0)一致性為65.9%。Sm6PGDH屬于NADP(+)依賴性脫羧磷酸葡萄糖酸脫氫酶，有完整的Gnd結(jié)構(gòu)域，是Gnd超基因家族的成員。

2.2Sm6PGDH的生物信息學(xué)預(yù)測分析Sm6PGDH的等電點(diǎn)為6.68，理論相對分子量約為53.84 kDa，略偏酸性。由C、H、O、N、S 共5種原子共同組成。其中，含量前列的氨基酸為甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)和絲氨酸(Ser)，其含量分別為10.8%、9.8%、7.3%、7.1%。Sm6PGDH氨基酸序列分析中未發(fā)現(xiàn)含有信號肽，并且非經(jīng)典途徑分泌軟件預(yù)測得到數(shù)值較低，則其應(yīng)是一個(gè)胞內(nèi)蛋白分子。Sm6PGDH二級結(jié)構(gòu)分析得出該分子主要以α螺旋(H)為主，其占比為49.29%，β折疊(E)和無規(guī)則卷曲(O)的占比分別為11.00%、39.71%。此外，該蛋白的氨基酸序列中共有29.53%的可溶性的氨基酸殘基暴露在溶液界面中，含有59.67%的氨基酸其殘基嵌于蛋白內(nèi)部。

2.3Sm6PGDH糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)和乙?；稽c(diǎn)預(yù)測分析 利用DictyOGlyc-1.1分析工具預(yù)測Sm6PGDH蛋白質(zhì)在Ser143位點(diǎn)存在一個(gè)O-糖基化(見圖1，A)。Net Phos分析顯示，編碼的氨基酸序列中存在潛在的磷酸化位點(diǎn)共39個(gè)，22個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)、12個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)(見圖1，B)。利用NetAcet分析工具預(yù)測Sm6PGDH的N末端不存在乙?；稽c(diǎn)。

圖1 Sm6PGDH氨基酸序列中o-GlcNAc糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.1 O-glycosylation site and phosphorylation site prediction for Sm6PGDH

2.4Sm6PGDH的B細(xì)胞表位 通過B細(xì)胞線性表位分析軟件預(yù)測，Sm6PGDH的氨基酸序列中可能存在9個(gè)潛在有效的B細(xì)胞表位(表1)。

表1 Sm6PGDH的B細(xì)胞表位Tab.1 B cell epitopes of Sm6PGDH

2.5Sm6PGDH基因的全長擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 利用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增得到全長序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示分子量在1 500 bp左右的位置出現(xiàn)特異性條帶(見圖2A)；將全長序列克隆到原核表達(dá)中，重組質(zhì)粒雙酶切鑒定顯示2個(gè)條帶，分別在1 500 bp和5 400 bp在位置(圖2B，第4泳道)。

A：Sm6PGDH基因的全長序列，第1泳道是Sm6PGDH擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶；M是DNA Marker DL2000。B：重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Sm6PGDH的雙酶切鑒定。M1：DNA Marker DL2000；1：全長基因PCR產(chǎn)物；2：pET-28a(+)載體；3重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Sm6PGDH；4：重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Sm6PGDH雙酶切所得產(chǎn)物(分別在1 500 bp位置和5 400 bp位置)；M2：DNA Marker DL1500。圖2 Sm6PGDH基因的全長擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定Fig.2 PCR analysis of Sm6PGDH and identification of the recombinant plasmid

2.6 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 含有重組質(zhì)粒的大腸埃希菌分別在28 ℃和37 ℃下誘導(dǎo)不同的時(shí)間，通過圖3發(fā)現(xiàn)，在37 ℃下誘導(dǎo)4 h蛋白的表達(dá)量最高，利用親和層析柱得到分子量55 kDa的目的蛋白。利用His抗體進(jìn)行純化蛋白鑒定，在目的分子量位置得到目的條帶。

A.1:未經(jīng)誘導(dǎo)的pET-28a(+)空載體；2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a(+)空載體；3：未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Sm6PGDH；4、5：在28 ℃下誘導(dǎo)2 h和4 h的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Sm6PGDH；6、7、8：在37 ℃下誘導(dǎo)2 h、4 h、5 h的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Sm6PGDH；M:Protein Marker。B.M:Protein Marker; 1、2、3：Sm6PGDH純化蛋白；C.Sm6PGDH純化蛋白的His抗體鑒定。圖3 Sm6PGDH重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定 Fig.3 Expression and identification of recombinant Sm6PGDH

2.7 不同濃度葡萄糖培養(yǎng)裂頭蚴的轉(zhuǎn)錄水平差異

Sm6PGDH在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)裂頭蚴體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平存在差異，與正常組裂頭蚴相比較，在無糖組、低糖組和高糖組分別高出3倍、5倍和5.3倍，見圖4。

圖4 Sm6PGDH在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)裂頭蚴中轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.4 Transcriptional levels of Sm6PGDH in sparganum exposed to different concentrations of glucose

3 討 論

戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway，PPP)是生物體糖代謝的重要途徑之一，是生物合成NADPH的主要來源。6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵限速酶之一，它催化6-磷酸葡萄糖酸氧化脫羧轉(zhuǎn)化形成5-磷酸核酮糖，伴隨著NADPH的合成[12]。NADPH主要參與合成代謝，如氨基酸、脂類及核苷酸等細(xì)胞組成物質(zhì)的合成都需要NADPH，對細(xì)胞正常生長和代謝有重要的影響。5-磷酸核酮糖參與核酸的合成，為其合成提供戊糖[13]。因此，6PGDH在生物的生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。

目前，對6PGDH的研究主要集中在原核生物、植物以及真菌，而該酶在寄生蟲中的研究較少，對于曼氏裂頭蚴的6PGDH研究尚屬空白。對于寄生蟲而言，磷酸戊糖途徑中關(guān)鍵酶是必不可少的，這些酶與它們所寄生哺乳動(dòng)物中的同源性酶在結(jié)構(gòu)上有所差異，因此，可以作為抗寄生蟲藥物的靶點(diǎn)[14]。

通過NCBI數(shù)據(jù)庫分析顯示Sm6PGDH是一個(gè)NADP(+)依賴性脫羧磷酸葡萄糖酸脫氫酶，是Gnd超基因家族的成員。Sm6PGDH與其他絳蟲同源基因的核苷酸序列一致性較高，與人的同源核苷酸序列一致性達(dá)60%以上，為此，該酶在物種進(jìn)化上較為保守。Sm6PGDH的氨基酸序列中不具有信號肽也不能通過非經(jīng)典途徑分泌，是一個(gè)疏水性的胞內(nèi)蛋白分子。在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)裂頭蚴中Sm6PGDH的轉(zhuǎn)錄水平都比正常組高，在低糖組和高糖組中的轉(zhuǎn)錄水平不存在差異，該酶在寄生蟲適應(yīng)外界環(huán)境中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用，其作為一個(gè)糖代謝途徑的酶分子，在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝和合成NADPH用于其他生物成分合成。

在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋和β折疊在維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性上發(fā)揮重要作用，而無規(guī)則卷曲所形成的二級結(jié)構(gòu)比較松散更容易發(fā)生變形，這更有利于形成酶活性部位和特異的功能部位，更有利于與底物、配體或是抗體相結(jié)合，而發(fā)揮生物學(xué)功能[15-17]。本文通過Predictprotein預(yù)測Sm6PGDH二級結(jié)構(gòu)中以α螺旋為主，無規(guī)則卷曲的占比為39.71%，說明該蛋白整體結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，無規(guī)則卷曲占比高這一特征可能更有利于生物學(xué)功能的發(fā)揮。免疫特性預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有9個(gè)有效的B細(xì)胞線性表位，這提示寄生蟲可以通過這些表位介導(dǎo)蟲體的體液免疫，并且可能有效地調(diào)節(jié)特異性抗體的類型，提高抗體的免疫殺傷能力。在Sm6PGDH序列分析中，我們還發(fā)現(xiàn)在Ser143存在1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)可能更有利于病原體識別和免疫響應(yīng)[18-19]。此外，該蛋白分子的序列中還存在潛在的39個(gè)磷酸化位點(diǎn)，蛋白在磷酸化作用后，蛋白質(zhì)便具有了電荷，從而使整個(gè)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)一步引起蛋白質(zhì)活性的變化[20-22]。此外，本研究通過原核表達(dá)該蛋白，從上清液中分離純化到水溶性的蛋白分子，并利用底物開展了酶學(xué)活性的研究，但發(fā)現(xiàn)得到的上清純化蛋白分子并未表現(xiàn)出活性，其原因可能是該蛋白的氨基酸序列中含有糖基化位點(diǎn)和多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，在原核表達(dá)系統(tǒng)中，不具有糖基化和磷酸化的修飾，為此本研究得到的純化蛋白不具有活性。若開展該蛋白在活性功能方面研究，則需要利用真核表達(dá)獲得修飾后的蛋白才具有活性。

綜上所述，Sm6PGDH在同源序列比對中，與其他絳蟲的同源性較高，且具有較多的免疫表位，提示可以進(jìn)一步探究該分子是否可作為開發(fā)廣譜抗寄生的疫苗分子。此外，Sm6PGDH是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶分子，本研究得到的Sm6PGDH蛋白可以為在裂頭蚴的糖代謝的規(guī)律研究中提供了物質(zhì)保障。

利益沖突：無

引用本文格式：郝潤蓮，劉錦騰，林于今，等. 曼氏裂頭蚴6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因克隆、蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：963-969. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.142