胡瑋琳, 夏文浩, 任雨軒

鉤端螺旋體病是一種全球流行的自然疫源性人獸共患病，也是我國重點監(jiān)控并列入計劃免疫項目的傳染病[1]。接種疫苗是預(yù)防傳染病最有效的措施之一。目前鉤體疫苗產(chǎn)品為多價全菌滅活苗，其對菌苗未包含的血清群感染無明顯的保護(hù)作用。最近我國部分地區(qū)出現(xiàn)了菌群更迭感染引起的鉤體病流行[2-5]。因此，研制對不同血清群有交叉保護(hù)作用的通用性新疫苗，對于該疾病的防控具有極為重要的意義。

外膜蛋白是革蘭陰性菌主要表面抗原，也是亞單位疫苗研發(fā)的對象。國內(nèi)外研究顯示，重組問號鉤體Lig、LipL32、Loa22等外膜蛋白具有良好的免疫原性和保護(hù)性[6-10]。目前普遍使用工程菌串聯(lián)表達(dá)多種外膜蛋白，該方法獲得的大分子融合蛋白表達(dá)量低下是制約重組蛋白亞單位疫苗研發(fā)的瓶頸，而表位是抗原蛋白中負(fù)責(zé)引發(fā)免疫應(yīng)答的小分子肽片段，其中優(yōu)勢表位代表或決定抗原蛋白主要免疫原性。因此，表位疫苗是近年基因工程疫苗研制熱點，具有能同時提呈多個表位、抗原提呈作用強(qiáng)、分子量小、免疫效果好等優(yōu)點。本研究采用生物信息學(xué)結(jié)合表位芯片技術(shù)篩選問號鉤體主要抗原蛋白中的優(yōu)勢表位，為研制有廣泛交叉保護(hù)作用的疫苗提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng) 鉤端螺旋體黃疸出血群賴型56601株、爪哇群爪哇型56602株、秋季群秋季型56606株、澳洲群澳洲型56607株、波摩那群波摩那型56608株、流感傷寒群臨型56609株、七日熱群七日熱型56610株以及曼耗群清水型56615株保存于本實驗室，采用EMJH液體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)上述鉤體株[11]。

1.2 外膜蛋白基因擴(kuò)增 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Axygen)提取上述鉤體基因組DNA，使用Nanodrop測定其濃度和純度。采用PCR擴(kuò)增ligB、loa22、lipL32基因，引物(表1)由杭州擎科生物有限公司進(jìn)行合成。PCR總體積50 μL，采用Phanta○RUc Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒(Vazyme)，內(nèi)含0.2 mmol/L dNTP Mix、0.4 μmol/L各上下游引物、1U Phanta高保真酶、100 ng DNA模板、1×Uc緩沖液。PCR參數(shù)：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。采用TS-GelRed核酸凝膠染料(Tsingke)預(yù)染的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Axygen)純化上述片段，委托杭州擎科生物有限公司測序。

表1 鉤體基因PCR檢測引物序列Tab.1 Primer sused for leptospiral gene detection by PCR

1.3 主要外膜蛋白中抗原表位預(yù)測 分別采用抗原表位預(yù)測軟件SYFPEITHI epitope prediction(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)、EMBOSS antigenic(http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/antigenic)預(yù)測T細(xì)胞和B細(xì)胞表位[12-13]。打開SYFPEITHI軟件后選擇MHC II類(15 aa)，綜合各HLA-DRB1亞型打分排序，選取分值≥25的預(yù)測T細(xì)胞表位序列進(jìn)行后續(xù)分析；打開EMBOSS antigenic軟件，設(shè)置抗原區(qū)aa≥6，對B細(xì)胞表位進(jìn)行打分排序，選取分值≥1的序列作進(jìn)一步分析。氨基酸序列同時含有T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，且長度不大于30 aa判定為T-B聯(lián)合表位。

1.4 全菌抗血清及IgG制備 大鼠抗鉤體56601、56606、56607、56608、56609、56610、56602、56615株全菌血清由本實驗室提供。采用抗體純化磁珠(Beaver BeadsTMProtein A/G，海貍生物)分離血清中IgG。

1.5 芯片法檢測抗原表位免疫反應(yīng)性 抗原表位肽委托上海吉爾生化(GL Biochem)有限公司合成，HPLC純度95%。表位肽定制芯片委托上海卓立生物科技有限公司制備并測試。具體測試步驟如下：將制備好的芯片固定于芯片雜交架，使用含有5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉芯片1 h。使用0.5% PBST清洗2次后使用PBS清洗。取1∶100稀釋后各抗血清IgG一抗加入到相應(yīng)孔中，室溫孵育2 h。按上述方法清洗芯片后，使用Biotin標(biāo)記山羊抗大鼠1∶2 500稀釋二抗加入到雜交孔中，室溫孵育2 h后，同樣使用上述方法清洗芯片。取稀釋后SA-cy5加入到雜交孔中，室溫水平搖床孵育20 min。使用0.5% PBST清洗芯片2次后，PBS清洗1次，去離子水清洗1次，干燥后掃描讀數(shù)。計算各芯片位點發(fā)光強(qiáng)度信噪比(Signal to noise ratio, SNR)，即SNR=(信號強(qiáng)度-背景強(qiáng)度)/背景強(qiáng)度，當(dāng)SNR≥2視為陽性。同時，實驗中設(shè)置BSA點制孔以及健康大鼠血清IgG組作為陰性對照。在篩選芯片上陽性信號點時，結(jié)合該位點的信號強(qiáng)度、重復(fù)性與信噪比綜合考慮。

2 結(jié) 果

2.1 基因擴(kuò)增及測序結(jié)果 本文所列致病性鉤體基因組中均可檢出ligB、loa22、lipL32基因片段(圖1)。序列分析結(jié)果顯示，與我國最為流行的黃疸出血群賴型56601株相比，其他不同基因種、血清群致病性鉤體上述基因翻譯后氨基酸序列相似性為89.42%～98.63%(LigB)、92.82%～100%(Loa22)和98.53%～100%(LipL32)。

M：DNA Marker圖1 抗原蛋白編碼基因在不同鉤體中的分布情況Fig.1 Distribution of genes encoding antigenic proteins in different Leptospira

2.2 T-B聯(lián)合抗原表位預(yù)測結(jié)果及表位選擇 根據(jù)T和B細(xì)胞表位預(yù)測排序及其序列重合情況，確定30個候選T-B聯(lián)合抗原表位(表2)。

2.3 抗原表位肽芯片中各表位免疫反應(yīng)性 芯片掃描結(jié)果顯示，大多數(shù)抗原表位肽能與大鼠抗問號鉤體全菌-IgG產(chǎn)生雜交信號。其中，LigB-6、LigB-10、LigB-11、LigB-15、LigB-16、LigB-17、LigB-20、Loa22-3、LipL32-3有很強(qiáng)的雜交信號，LigB-1、LigB-7、LigB-9、LigB-19、LipL32-4雜交信號較強(qiáng)，其余抗原表位雜交信號微弱(圖2)。

表2 鉤體主要外膜蛋白抗原表位預(yù)測結(jié)果Tab.2 Predicted antigenic epitopes of major outer member proteins in leptospira

圖2 表位芯片系統(tǒng)檢測優(yōu)勢抗原表位結(jié)果Fig.2 Predominant antigenic epitopes detected by the epitope chip system

3 討 論

鉤體病又稱Weil’s病，是全世界流行的人獸共患傳染病。鼠、豬和犬是自然界重要宿主，鉤體隨動物尿液排出污染環(huán)境，人通過接觸疫水、屠宰牲畜間接接觸病原菌而感染[14-16]。

注射疫苗是防治鉤體病的方法之一。通常，易與抗原識別受體或抗體結(jié)合的功能性表位位于抗原物質(zhì)表面，故本研究選取鉤體外膜蛋白作為候選抗原研究對象。Lig家族蛋白是鉤體感染時的主要抗原，其中LigB廣泛分布于不同血清群致病鉤體，Conrad等構(gòu)建的LigB蛋白保守區(qū)域/氫氧化鋁佐劑亞單位疫苗在倉鼠模型中有效率達(dá)87.5%～100%[9]；OmpA家族蛋白Loa22是鉤體感染過程中明顯上調(diào)表達(dá)的抗原，Loa22蛋白與鉤體顯微凝集試驗陽性血清的ELISA敏感性和特異性分別為77.84%和86.15%，殼聚糖遞送loa22基因DNA疫苗在小鼠模型中有較高的免疫原性[10, 17]；LipL32是鉤體外膜中含量最高的蛋白，病人血清中可以檢查出抗該蛋白的IgM，重組表達(dá)LipL32蛋白與卡介苗混合接種倉鼠后具有顯著的免疫保護(hù)作用[7-8, 18]；以上研究提示上述3種鉤體外膜蛋白是良好的候選疫苗靶點。

表位疫苗是一種新型基因工程疫苗，將篩選出的優(yōu)勢多抗原表位整合至特定載體后，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，提高免疫保護(hù)作用。研究證實表位疫苗有良好的開發(fā)前景，如：流感通用多表位疫苗M-001在臨床試驗中對甲型、乙型流感有廣泛的免疫保護(hù)作用[19]；布魯氏菌Omp2b蛋白T-B聯(lián)合抗原表位疫苗可以產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[20]；口蹄疫多表位疫苗免疫豚鼠后有良好的免疫保護(hù)作用[21]。目前鉤體表位疫苗的研究較少，Kumar P等2021年應(yīng)用免疫信息學(xué)和結(jié)構(gòu)分子動力學(xué)預(yù)測了鉤體的抗原表位及其免疫原性[22]，Pissawong T等2020年發(fā)現(xiàn)LipL3293-272肽段有很強(qiáng)的免疫原性[23]。綜上研究提示基于有效抗原篩選的優(yōu)勢表位有望為鉤體表位疫苗的研制提供支持。

本研究選取LigB、Loa22、LipL32共3個鉤體主要外膜蛋白作為代表進(jìn)行研究，結(jié)果證實LigB、Loa22、LipL32均廣泛存在于不同血清群的致病性鉤體中，是抗原肽疫苗的有效候選蛋白(圖1)。各抗原蛋白氨基酸序列在不同血清群的鉤體中相對保守，其中56601株、56606株、56607株、56608株、56609株、56610株同屬L.interrogans基因種，上述同基因菌株間氨基酸序列相似性高達(dá)98.46%(LigB)、99.4%(Loa22)、100%(LipL32)，56602株和56615株分別為L.borgpetersenii和L.weilii基因種，序列保守，但相似性較L.interrogans基因種之間略低。根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測抗原表位的評分情況，我們選擇30個T-B聯(lián)合抗原表位進(jìn)行研究。以往我們采用傳統(tǒng)的噬菌體展示肽結(jié)合免疫印跡法篩選抗原表位，存在實驗步驟繁雜、時效性不佳的缺點，此次合成短肽結(jié)合芯片檢測方法相比噬菌體展示肽結(jié)合免疫印跡法更方便易行，可一次性批量檢測眾多抗原表位的免疫原性?？乖男酒瑨呙杞Y(jié)果顯示：預(yù)測T-B聯(lián)合抗原表位與抗鉤體全菌IgG反應(yīng)時，LigB-6、LigB-10、LigB-11、LigB-15、LigB-16、LigB-17、LigB-20、Loa22-3、LipL32-3的免疫反應(yīng)性明顯高于其他表位，且上述抗原肽對各不同血清群鉤體抗血清IgG反應(yīng)性基本一致。

綜上所述，本文采用芯片法篩選鉤體外膜蛋白優(yōu)勢表位，在LigB、Loa22、LipL32蛋白中共獲得9個優(yōu)勢表位，上述表位序列保守且與不同血清群鉤體抗血清均可發(fā)生交叉反應(yīng)，可作為鉤體抗原肽疫苗侯選表位。

利益沖突：無

引用本文格式：胡瑋琳, 夏文浩, 任雨軒. 芯片法篩選鉤端螺旋體外膜蛋白抗原表位[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(11)：970-974. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.149