章樂(lè)怡，樓輝煌，李 毅，胡玉琴，林謙閣，周珊慧，符 彬，李晟愷

彎曲菌(Campylobacter)被認(rèn)為是發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家的細(xì)菌性腹瀉疾病的主要原因之一，大多數(shù)彎曲菌病是由于空腸彎曲菌引起。彎曲菌的來(lái)源廣泛，而人類接觸零售肉類已被確定為彎曲菌病的主要危險(xiǎn)因素[1]。美國(guó)2019年的一份報(bào)告中指出彎曲菌是最常見(jiàn)的食源性病原菌，每10萬(wàn)人中有19.5人感染[2]。近幾年我國(guó)的彎曲菌暴發(fā)事件也時(shí)有發(fā)生，北京、蘇州等地先后報(bào)道發(fā)生由彎曲菌感染所致的胃腸炎暴發(fā)事件[3-5]。2021年以來(lái)本市也發(fā)生多起起由彎曲菌引起的食源性疾病暴發(fā)事件。本研究針對(duì)2021年在溫州市某學(xué)校發(fā)生的一起急性食源性疾病暴發(fā)事件，通過(guò)對(duì)相關(guān)樣本進(jìn)行PCR快篩、雙孔濾膜法分離培養(yǎng)病原菌，并通過(guò)PFGE分型、全基因組測(cè)序，為今后彎曲菌引起的暴發(fā)事件的實(shí)驗(yàn)室確診及溯源分析提供經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 2021年5月，溫州某小學(xué)發(fā)生食源性疾病突發(fā)事件，學(xué)生病例均多日在學(xué)校連續(xù)就餐，食譜中出現(xiàn)三黃雞。采集食堂環(huán)境涂抹樣本 3份，食堂員工(無(wú)癥狀)糞便標(biāo)本6份(14日采樣)，學(xué)生病例糞便標(biāo)本23份(因發(fā)病時(shí)間不同，于5月11日、12日、14日3天陸續(xù)采樣)，鑒于食譜中出現(xiàn)過(guò)三黃雞，但無(wú)留樣，于23日采集4份提供食堂三黃雞的某禽業(yè)公司銷售的三黃雞。

1.2 主要儀器和試劑 全自動(dòng)微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)MALDI Biotyper Smart(布魯克北京科技有限公司)；FilmArray快速多重 PCR 分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃)、CHEF Mapper 型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、Gel XR 型凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；FilmArray胃腸道疾病(GI) 測(cè)試條(法國(guó)生物梅里埃)；雙孔濾膜法彎曲菌培養(yǎng)基(ZC-CAMPY-001)、彎曲菌瓊脂稀釋法抗生素最低抑菌濃度(MIC)檢測(cè)試劑盒(ZC-AST-001)購(gòu)自青島中創(chuàng)匯科科技有限公司；全基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自天津諾禾致源生物信息科技有限公司)，所有試劑在有效期內(nèi)使用。測(cè)序由杭州微數(shù)生物科技有限公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.3.1 PCR檢測(cè) 對(duì)第1次采樣(11日)的9份腹瀉學(xué)生糞便樣本用熒光定量PCR法進(jìn)行了諾如病毒核酸檢測(cè)，對(duì)第2次采樣(12日)的10份腹瀉學(xué)生糞便樣本，制成2個(gè)混樣(5份為一個(gè)混樣)，采用胃腸道疾病(GI) 測(cè)試條，進(jìn)行13 種細(xì)菌、5 種病毒、4種原生動(dòng)物共22 種常見(jiàn)胃腸道病原快速篩查。

1.3.2 彎曲菌分離培養(yǎng) 對(duì)27份樣本，包括14份學(xué)生病例樣本(包括12日采樣的10份樣本和14日采樣的4份樣本)、6份食堂員工糞便樣本(14日采樣)、3份環(huán)境涂抹樣本、4份三黃雞進(jìn)行了分離培養(yǎng)，采用雙孔濾膜法分離彎曲菌，42 ℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h，鏡檢形態(tài)為G-、弧形、S形或螺旋形等可疑菌落進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定，分型鑒定采用質(zhì)譜法。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI推薦的彎曲菌瓊脂稀釋法(Agar Dilution Method)對(duì)分離的空腸彎曲菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。包含了7大類11種抗菌藥物：氨基糖苷類：慶大霉素(Gentamicin，GEN)、鏈霉素(Streptomycin，STR)；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素(Erythromycin，ERY)、阿奇霉素(Azithromycin，AZI)；喹諾酮類及氟喹諾酮類：萘啶酸(Nalidixic acid，NAL)；環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)；氯霉素類：(氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)LO)；四環(huán)素類：四環(huán)素 (Tetracycline，TET)；林可酰胺類：克林霉素(Clindamycin，CLI)；酮內(nèi)酯類：泰利霉素(Telithromycin, TEL) 等11種抗生素。空腸彎曲菌ATCC33560 作為質(zhì)控菌株。42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h后讀結(jié)果。記錄彎曲菌對(duì)各類藥物的最低抑菌濃度值(MIC值)，根據(jù)美國(guó)NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring System)標(biāo)準(zhǔn)(https://www.cdc.gov/narms/antibiotics-tested.html)對(duì)彎曲菌的耐藥進(jìn)行判定。耐藥折點(diǎn)值：AZI(≥8 μg/mL)、CIP(≥4 μg/mL)、ERY(≥32 μg/mL)、GEN(≥8 μg/mL)、TET(≥16 μg/mL)、FLO(≥8 μg/mL)、CHL(≥32 μg/mL)、STR(≥16 μg/mL)、NAL(≥64 μg/mL)、TEL(≥16 μg/mL)、CLI(≥8 μg/mL)。

1.3.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型方法 空腸彎曲菌的PFGE分子分型操作方法按照美國(guó)PulseNet公布的標(biāo)準(zhǔn)程序http://www.cdc.gov/pulsenet/protocols/campy_protocol.pdf進(jìn)行。細(xì)菌懸液調(diào)整比濁值為5.5～6.0個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬拗菩詢?nèi)切酶使用SmaⅠ，酶切時(shí)間為4 h，PFGE電泳條件 6.76～35.38 s，電泳時(shí)間18 h。電泳圖譜使用BioNumeric 7.6軟件分析菌株同源性。

1.3.5 全基因測(cè)序 將菌株接種至血平板復(fù)蘇活化，42 ℃微需氧培養(yǎng)，刮取新鮮菌落, 用全基因組DNA試劑盒進(jìn)行提取后外送測(cè)序。序列結(jié)果用Fastqc軟件進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，使用國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)上的基因組數(shù)據(jù)分析軟件將原始序列進(jìn)行de novo 組裝，序列組裝以后進(jìn)行拼接，數(shù)據(jù)分析上傳pubmlst網(wǎng)站(https://pubmlst.org/organisms/campylobacter-jejunicoli/)進(jìn)行基因組水平的遺傳特征分析。

數(shù)據(jù)上傳抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫(kù)ncbi/AMRFinder查找空腸彎曲菌基因組中的耐藥基因并進(jìn)行比較[6]。設(shè)置%ID 的閾值為90%，最小長(zhǎng)度比例為 90%。毒力基因則參照毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)(Virulence Factors Database, VFDB, http://www.mgc.ac.cn/VFs/)進(jìn)行查找分析。

2 結(jié) 果

2.1 流行病學(xué)結(jié)果 2021年5月11日，區(qū)疾控中心接到某小學(xué)報(bào)告，該校多個(gè)班級(jí)學(xué)生出現(xiàn)腹痛、腹瀉?，F(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，這個(gè)學(xué)校共有670名學(xué)生，教職工48名。食堂有10名工作人員，自述近期無(wú)腹瀉、嘔吐癥狀。共發(fā)現(xiàn)學(xué)生病例23例，學(xué)生罹患率為3.43%(23/670)，均為輕癥病例，無(wú)住院病例。23例病例中，臨床表現(xiàn)以腹瀉、腹痛為主占91.30%(21/23)，惡心占60.87%(14/23)，發(fā)熱占47.83%(11/23)，嘔吐39.13%(9/23)。第1例患者和最后1例患者的發(fā)病時(shí)間分別是5月9日和5月12日。

2.2 衛(wèi)生學(xué)調(diào)查 學(xué)校為學(xué)生提供中餐，由學(xué)校食堂燒制。查看食堂5月6日-12日間的食材，其中有臘雞翅、三黃雞、鱈魚、排骨、西紅柿、黃瓜、雞蛋等，食堂無(wú)專用熟食加工間，加工間所用刀具和砧板，放置于同一板架，無(wú)生熟標(biāo)識(shí)。

2.3 多病原PCR篩查結(jié)果 因基層疾控初步懷疑諾如病毒，第1次采樣(11日)的樣本僅進(jìn)行諾如病毒核酸檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。對(duì)12日采樣的10份學(xué)生病例樣本制成2份混樣用FilmArray胃腸道疾病(GI) 測(cè)試條篩查后，結(jié)果表明兩份混樣彎曲菌屬核酸均陽(yáng)性。

2.4 培養(yǎng)結(jié)果 對(duì)27份樣本進(jìn)行彎曲菌培養(yǎng)，結(jié)果7份學(xué)生病例樣本中檢出空腸彎曲菌(其中12日采樣的10份樣本檢出3份，14日采樣的4份樣本全部檢出)，蒸柜容器把手涂抹、刀具砧板涂抹樣本均檢出空腸彎曲菌。后續(xù)采集的4份三黃雞2份檢出結(jié)腸彎曲菌。

2.5 空腸彎曲菌PFGE分型結(jié)果 9株空腸彎曲菌(分別來(lái)自7份病例樣本和2份環(huán)境涂抹樣本)，經(jīng)PFGE分子分型后進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示9株空腸彎曲菌分為4種帶型，其中3份病例樣本和環(huán)境涂抹樣本(蒸柜容器把手涂抹) 的分離株克隆聚集成簇，帶型完全一致，相似性為100%，標(biāo)記為WZKW050 型，系同一克隆株；另2份病例樣本和環(huán)境涂抹樣本(刀具砧板涂抹)為同一帶型，這3株帶型標(biāo)記為 WZKW051型；其他兩份病例樣本的PFGE帶型均不同，病例5的PFGE帶型和WZKW051型相似度為92.3%，病例7的PFGE帶型則和其他菌有較大的差異，相似度為僅達(dá)60%。如圖1。

圖1 9株空腸彎曲菌PFGE聚類結(jié)果圖Fig.1 PFGE clustering results for nine Campylobacter jejuni isolates

2.6 空腸彎曲菌藥敏結(jié)果和耐藥基因結(jié)果 9株空腸彎曲菌對(duì)7大類11種抗生素的耐藥率結(jié)果表明，分離株對(duì)四環(huán)素類和喹諾酮類耐藥率較高，分別為77.8%(7/9)、55.6%(5/9)。8株彎曲菌分離株對(duì)至少一類抗菌藥物耐藥，1株菌株全部敏感，兩株病人菌株表現(xiàn)出多重耐藥。其中MLST和PFGE相同的菌株的耐藥譜不完全一致。見(jiàn)表1。

經(jīng)ncbi/AMRFinder分析發(fā)現(xiàn)：9株彎曲菌共含有blaZ、blaI、blaOXA-193、blaOXA-184、aadD1、aph(2″)-If、aph(3′)-IIIa、gyrA、tet(K)、tet(O)、catA13、50S_L22等12種耐藥基因，9株彎曲菌分離株均檢測(cè)AMR基因陽(yáng)性，6株菌攜帶3種以上抗生素耐藥基因。而發(fā)現(xiàn)最多的耐藥基因?yàn)閎laOXA-193，blaOXA-193編碼β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。其次為gyrA、tet(O)，分別編碼喹諾酮類、四環(huán)素類的耐藥性。其中7株四環(huán)素耐藥的菌株中5株攜帶tet(O)、tet(K) 基因。4株喹諾酮類耐藥的菌株全攜帶gyrA基因，所有g(shù)yrA基因86位點(diǎn)發(fā)生T-I突變，有2株分離株核蛋白體50S_L22位點(diǎn)發(fā)生了突變。

表1 9株空腸彎曲菌分離株的藥敏試驗(yàn)及和耐藥基因結(jié)果Tab.1 Antimicrobial susceptibility testing and resistance genes for nine Campylobacter jejuni isolates

2.7 空腸彎曲菌基因組基本信息和cgMLST分析 基因組序列長(zhǎng)度和 GC 含量是生物最基本的遺傳特征。9株彎曲菌基因組大小在1 521 609～1 724 352 bp，基因數(shù)量在1 693～2 285，GC含量在52.48%～53.93%，基因平均長(zhǎng)度在781.49～945.87 bp。其中MLST和PFGE分型相同的菌株的基因組大小、基因數(shù)量以及GC含量不完全一致，但非常接近，由于純二代測(cè)序的細(xì)菌基因組完整度沒(méi)有達(dá)到完成圖的水平，故樣本間基因組統(tǒng)計(jì)參數(shù)可能會(huì)有差異，見(jiàn)圖2。

每個(gè)彎曲菌的cgMLST類型都是利用彎曲菌核心基因組的1 343個(gè)位點(diǎn)的等位基因序列進(jìn)行分配的[7]。按cgMLST200分類，有7株彎曲菌分別屬于cgMLST200-186和cgMLST200-54兩個(gè)群，另2株菌未被分群。按7個(gè)管家基因MLST分類，9株空腸彎曲菌分為4種ST型(ST2031、ST11105、ST7533、ST11106)，其中ST11105、ST11106是我們提交至數(shù)據(jù)庫(kù)產(chǎn)生的新ST型。蒸柜容器把手涂抹分離的空腸彎曲菌和3份病例樣本分離株同為 ST11105型，cgMLST聚類在一起，屬cgMLST200-54群；刀具砧板表面涂抹分離的空腸彎曲菌和另2個(gè)病例分離株同為ST2031型，屬cgMLST200-186群；病例5和病例7的ST型為ST11106和ST7533。ST7533和最接近的cgMLST的錯(cuò)配高達(dá)1 100個(gè)等位基因，是一株數(shù)據(jù)庫(kù)里少見(jiàn)的類型。

圖2 9株空腸彎曲菌分離株的最小進(jìn)化樹(shù)圈圖Fig.2 Minimum spanning tree of nine Campylobacter jejuni isolates

2.8 空腸彎曲菌全基因組毒力基因結(jié)果 測(cè)序結(jié)果上傳到毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果表明9株彎曲菌基因組都包含多個(gè)毒素基因，共獲得168個(gè)毒力基因，其中86個(gè)分別屬于與侵襲力、黏附(定殖)、外毒素、翻譯后修飾、免疫調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散相關(guān)的6大類毒力基因。MLST和PFGE分型相同的菌株所含的毒力基因完全一致，其中ST11105的菌株含126個(gè)毒力基因，ST2031的菌株含123個(gè)毒力基因，均涵蓋了上述6大類毒力基因。

3 討 論

彎曲菌被認(rèn)為是發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家的細(xì)菌性腹瀉疾病的主要原因。彎曲菌也是本市主要的食源性致病菌，監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明2017-2019年腹瀉病例彎曲菌檢出率為 10.2%，高于同一時(shí)期本市兩家監(jiān)測(cè)點(diǎn)醫(yī)院沙門菌、副溶血弧菌的陽(yáng)性率(0.9%、8.1%)[8]。

本起彎曲菌事件發(fā)生在學(xué)校，且傳染鏈較復(fù)雜?；鶎蛹部刂行膶?duì)這事件的最初判斷病原體為諾如病毒，故對(duì)第一次樣本的檢測(cè)僅限于諾如病毒，結(jié)果均為陰性。后續(xù)樣本我中心采用胃腸道多病原體測(cè)試條對(duì)混樣快篩后進(jìn)行彎曲菌培養(yǎng)。但由于樣本沒(méi)有及時(shí)上送且保存不當(dāng)，部分樣本沒(méi)有成功分離出彎曲菌。故建議對(duì)今后應(yīng)急事件中不能及時(shí)培養(yǎng)的樣本需4 ℃保存，在24 h內(nèi)完成增菌。

本研究對(duì)分離的9株空腸彎曲菌 PFGE 分型及全基因組聚類分析結(jié)果顯示，9株空腸彎曲菌分為4種克隆型，表明本次來(lái)源復(fù)雜，至少有4種彎曲菌克隆型存在。發(fā)病病例陸續(xù)4 d均有出現(xiàn)，外環(huán)境樣本采集離首發(fā)病例已經(jīng)5 d，然而外環(huán)境樣本涂抹分離的空腸彎曲菌與陸續(xù)采樣的病例分離株基因型完全一致，表明外環(huán)境污染的彎曲菌一直存在，且有可能再次污染食物導(dǎo)致學(xué)生陸續(xù)發(fā)病。然而由于沒(méi)有剩余的食品無(wú)法進(jìn)一步溯源。鑒于前幾年本市彎曲菌食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中雞肉空腸彎曲菌攜帶率高達(dá)43.2%[9]，后期我們對(duì)提供學(xué)校食材的禽業(yè)公司銷售的三黃雞進(jìn)行采樣，檢出結(jié)腸彎曲菌，雖不能溯源到本次事件，但說(shuō)明禽業(yè)公司的雞受彎曲菌污染的嚴(yán)重程度。

近年來(lái)全基因組測(cè)序技術(shù)被廣泛用于食源性疾病研究，我國(guó)各地彎曲菌病的監(jiān)測(cè)和暴發(fā)也開(kāi)始使用WGS技術(shù)。WGS 有較高分辨率、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可用于確定疾病暴發(fā)中分離株的相關(guān)性，以揭示細(xì)菌的傳播關(guān)系及疾病的來(lái)源[10]。測(cè)序數(shù)據(jù)在經(jīng)處理和分析后可用來(lái)快速識(shí)別群落的基因型特征，如毒力基因和耐藥基因等。cgMLST利用高密度的核心基因組作為標(biāo)記，構(gòu)建高分辨率的物種分型結(jié)果，cgMLST200是在cgMLST基礎(chǔ)上允許分離株之間有200個(gè)等位基因的差異進(jìn)行分型[11]。本起突發(fā)事件全基因組cgMLST的聚類和PFGE分型結(jié)果一致，表明這幾種分子分型方法均可以用來(lái)溯源，從分子水平證實(shí)了本次事件是由空腸彎曲菌污染所致。

病原菌的毒力因子與其疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，多個(gè)毒力基因可能同時(shí)起作用，使彎曲菌具有相對(duì)較高的毒力，了解病原菌的毒力基因情況對(duì)預(yù)測(cè)疾病有一定的意義。結(jié)果表明分離的彎曲菌的所有基因組都包含多個(gè)毒素基因，這表明幾乎所有的分離株都具有潛在的致病性。

空腸彎曲菌的藥敏及全基因組耐藥基因結(jié)果表明，攜帶耐藥基因的菌株并沒(méi)有完全在表型中表達(dá)。在4株喹諾酮類藥物耐藥菌株中均發(fā)現(xiàn)了gyrA突變，gyrA基因86位點(diǎn)發(fā)生T-I突變。gyrA的T86I是喹諾酮類耐藥彎曲菌分離株中最常見(jiàn)的位點(diǎn)突變[12-13]。2株分離株核蛋白體50S_L22位點(diǎn)發(fā)生了突變，但對(duì)阿奇霉素和紅霉素并沒(méi)有耐藥，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，這個(gè)突變是和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)的，當(dāng)然位點(diǎn)突變產(chǎn)生抗性需要許多其他基因進(jìn)行協(xié)同，通常彎曲菌23S rRNA基因2074和2075位點(diǎn)突變是導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的最常見(jiàn)原因[14]，9株分離株均未發(fā)生這兩個(gè)位點(diǎn)的突變。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)cgMLST和PFGE相同的菌株的耐藥譜不完全一致，表明雖然這些菌株基因型相同，但耐藥的表型和其耐藥機(jī)制有關(guān)，如耐藥是由于基因突變?cè)斐傻?，cgMLST分型并沒(méi)有體現(xiàn)耐藥基因的突變，在同一克隆群傳播過(guò)程中也可能導(dǎo)致可移動(dòng)的耐藥基因或耐藥基因決定簇的丟失或獲得。彎曲菌病通常使用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌素治療，而喹諾酮類抗菌藥物，通常用于旅行者腹瀉或胃腸炎的一般病例[15-16]，因而今后還要進(jìn)一步對(duì)這類藥物的耐藥機(jī)制進(jìn)行研究。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：章樂(lè)怡，樓輝煌，李毅，等. 一起由空腸彎曲菌所致食源性疾病暴發(fā)事件的流行病學(xué)及病原學(xué)溯源分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：1012-1017. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.148