周慶安，黃勝斌，莫勝蘭，胡麗萍，韓銀華，甘 雨，藍(lán)惠華，林立亮，韋海娜，何奇松，韋顯凱，施開創(chuàng)，李 軍，郭建剛

蜱隸屬節(jié)肢動物門(Arthropoda，蛛形綱(Arachnida)，蜱螨亞綱(Acari)，寄螨總目(Parasitiformes)，蜱目(Ixodida)。下分硬蜱科(Ixodidae)，軟蜱科(Argasidae)，鈉蜱科(Nuttalliellidae)，其中最常見、危害最大的是硬蜱科，包括13個屬，其中有7個屬與獸醫(yī)關(guān)系密切。硬蜱寄生在家畜的體表，叮咬吸動物血液，引起宿主貧血、消瘦、皮膚炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展，造成嚴(yán)重的損失，還能傳播細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原體，近幾年來，因蜱蟲咬人引發(fā)的傳染病常有發(fā)生，顯然蜱和蜱傳疾病的危害已成為一個重大的社會公共衛(wèi)生問題。

硬蜱適合在溫暖潮濕的環(huán)境生長、發(fā)育、繁殖。廣西地處熱帶和亞熱帶地區(qū)，一年四季溫暖多雨的氣候，地貌多屬丘陵，植被茂盛，生態(tài)環(huán)境易滋生蜱蟲。牛、羊是硬蜱的易感動物，在廣西牛和羊多以散養(yǎng)或半圈半散養(yǎng)方式為主，與人活動的關(guān)系也較為密切。因此，通過現(xiàn)場調(diào)查廣西各地區(qū)牛、羊硬蜱攜帶情況，掌握硬蜱在廣西各地區(qū)家畜牛、羊分布情況，以及利用形態(tài)鑒定結(jié)合16S rDNA和COI生物分子標(biāo)志了解種類組成，為防控家畜牛、羊蜱蟲病和預(yù)防蜱媒傳染病提供參靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 柱式DNA核酸提取試劑盒購于哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號：YDNA-TQ 20200515P)，2×Tapplus PCR Maste mix、大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PMDTM18-T克隆載體、DL 2000 DNA Marker，購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；光學(xué)顯微鏡(MOTIC)、Bionetra TONE PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(UVITEC)、電泳儀購于北京六一儀器廠。

1.2 硬蜱樣品采集 從2019年1月至2021年11月，根據(jù)廣西14個市牛羊養(yǎng)殖情況，前往14個市46個縣區(qū)43戶散養(yǎng)牛，49個牛場，4戶散養(yǎng)羊，42個羊場，進(jìn)行硬蜱采樣。觀察牛羊家畜耳朵、腹股溝等體表是否有硬蜱寄生，然后采集放置昆蟲管中保存，總共采集2 030只硬蜱。

1.3 硬蜱形態(tài)學(xué)鑒定 運用光學(xué)顯微鏡觀察硬蜱的肛溝、盾板、眼、假頭基、須肢、口下板、氣門板、足基節(jié)有無分距、幾丁質(zhì)板等形態(tài)特點，然后根據(jù)陳澤等[1]發(fā)表的中國蜱類系統(tǒng)分類文獻(xiàn)，結(jié)合《醫(yī)學(xué)蜱螨學(xué)》蜱類分類檢索表進(jìn)行蜱類標(biāo)本形態(tài)學(xué)種、屬鑒定。

1.4 引物合成信息 運用PCR方法擴(kuò)增蜱16S rDNA和COI基因片段。16S rDNA和COI基因引物序列分別參靠Norris[2]和Vrijenhoek[3]。引物序列由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物信息如表1。

表1 蜱16S rDNA和COI基因片段擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for 16S rDNA and COIsequences

1.5 硬蜱分子學(xué)鑒定

1.5.1 硬蜱組織核酸抽提 根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定的初步結(jié)果，每個采樣點取一只硬蜱進(jìn)行分子學(xué)鑒定，其中柳州2只，南寧5只，北海2只，賀州2只，百色3只，防城港1只，河池6只，梧州3只，桂林2只，崇左2只，貴港6只，玉林1只，來賓1只，欽州市1只。根據(jù)硬蜱吸血程度優(yōu)先選取游離硬蜱，其次半飽血和飽血進(jìn)行硬蜱組織核酸抽提。硬蜱洗凈后，把組織研磨成勻漿狀后，加入20 mg/L的蛋白酶K和裂解液后放置56 ℃水浴中進(jìn)行消化4 h，按照柱式DNA核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行抽提核酸，DNA保存于-20 ℃待用。

1.5.2 硬蜱16S rDNA、COI基因擴(kuò)增 反應(yīng)體系25 μL包括2×TaqMasterMix 12 μL，ddH2O 9 μL，上下游特異性引物各0.5 μL，抽提核酸3 μL，在95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s， 55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， (34 cycles)；72 ℃ 10 min條件下運行完成擴(kuò)增。取7 μL PCR產(chǎn)物加入1.5%的瓊脂糖凝膠，放入電泳儀在100 V， 66 mA條件下30 min電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察是否有特異性亮帶。

1.5.3 硬蜱16S rDNA、COI基因序列測序 經(jīng)16S rDNA，COI特異性引物擴(kuò)增后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，回收16S rDNA, COI目的片段，并在4 ℃條件下連接至PMD18-T后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受細(xì)胞，轉(zhuǎn)化至LB固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，挑起可疑菌落至LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定是陽性菌落后，送至廣州華大基因科技有限公司測序。

1.5.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 將本次成功測序的16S rDNA、COI基因序列在NCBI中注冊的序列進(jìn)行同源性對比，和GenBank上登錄的硬蜱科各屬種相應(yīng)的基因序列相似度比較，16S rDNA選取微小扇頭蜱(Rhipicephalusmicroplus)(JX051068、MN650726)、長角血蜱(Haemaphysalislongicornis)(KJ710091、KJ652225)、具角血蜱(H.cornigera)(AB819174)、亞東離眼蜱(Hyalommaasiaticum)(MG669107)、黑斑革蜱(Dermacentoratrosignatus)(MT912973)、美洲花蜱(Amblyommaamericanum)(L34314)、卵形硬蜱(Ixodesovatus)(MW063846)作為參照序列，COI選取種內(nèi)不同區(qū)域的微小扇頭蜱MT249801(比利時)、OK083457(百色)、OK083467(黃石)、MH788941(湖南)、JX051125(云南)、OM368329(武漢)、JQ737082(甘肅)；長角血蜱屬：MT465133(西安)、MT465129(漢中)、KY488667(山東)、MK408610(湖北)、OM368291(湖北)、MW642399(遼寧)；具角血蜱屬：OM368283(江西)；血蜱屬未定種：MH208698(山東)為參照序列。用MEGA5.2軟件中的Neighbor-Joining Tree，經(jīng)過1 000次的 Bootstrap計算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 各市牛羊場硬蜱寄生情況 在廣西14個地市中均采集到硬蜱，其中43戶散養(yǎng)牛均有硬蜱寄生，4戶散養(yǎng)羊有硬蜱寄生，29個牛養(yǎng)殖場和11個羊養(yǎng)殖場有硬蜱寄生。采集的硬蜱大多為寄生蜱，處于飽血或半飽血狀態(tài)，在一些體表被毛較長的宿主中收集少數(shù)游離蜱，各市牛羊養(yǎng)殖場有硬蜱寄生情況見表2。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察硬蜱的形態(tài)結(jié)構(gòu)后，根據(jù)文獻(xiàn)將肛溝很淺而不明顯，假頭基六角形，足基節(jié)Ⅰ有兩個粗短的距，其大小約相等的硬蜱鑒定為微小扇頭蜱(圖1-A、B)。小型蜱，假頭基矩形，無眼，雌性下口板齒式5/5，或至少主部5/5，雄性下口板齒式5/5，盾板刻點中等粗細(xì)，分布稠密而均勻的硬蜱鑒定為長角血蜱(圖1-C、D)。假頭基矩形，無眼、口下板齒式5/5，須肢第3節(jié)寬小于長，氣門板背突不明顯的硬蜱鑒定為具角血蜱(圖1-E、F)。其中微小扇頭蜱共1 968只，是廣西地區(qū)硬蜱種類分布優(yōu)勢種，分布廣西14個地市，宿主：牛、羊；而長角血蜱49只，分布于河池地區(qū)，宿主牛；具角血蜱13只，分布于河池地區(qū)和崇左憑祥市地區(qū)，宿主牛。各市蜱侵染宿主百分率詳見圖2。

表2 廣西地區(qū)各市牛羊場硬蜱調(diào)查結(jié)果Tab.2 Ixodes infection in cattle and sheep farms in Guangxi

2.3 分子學(xué)鑒定結(jié)果 微小扇頭蜱、長角血蜱、具角血蜱的16S rDNA基因片段大小為470 bp，而微小扇頭蜱、長角血蜱、具角血蜱的COI基因片段大小為710 bp，與預(yù)期相符合。經(jīng)測序后獲得33條微小牛蜱序列，其中柳州2條、南寧5條、北海2條、賀州2條、百色3條、防城港1條、河池3條、梧州3條、桂林2條、崇左1條、貴港6條、玉林1條、來賓1條、欽州1條；2條長角血蜱序列：河池2條；2條具角血蜱序列：河池1條，崇左1條。

2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果 將成功測序的16S rDNA、COI基因序列在NCBI中注冊的序列進(jìn)行同源性對比，與同種類相似度達(dá)90%以上。根據(jù)同源性及序列的數(shù)量選取序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。它們與參照的同屬蜱種序列在一個大支上，不同屬的蜱種在不同的大分支，如圖3、4。

A：微小扇頭蜱腹面；B：微小扇頭蜱背面；C：長角血蜱腹面；D：長角血蜱背面；E：具角血蜱背面；F：具角血蜱腹面(30×)。圖1 硬蜱形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphological structure of ixodes

圖2 牛、羊體表硬蜱種類地理分布情況Fig.2 Geographical distribution of ixodes ticks on body surfaces of cattle and sheep

圖3 基于16S rDNA基因不同蜱種的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of tick species based on partial 16S rDNA gene sequences

圖4 基于COI基因不同蜱種的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of tick species based on partial COI gene sequences

3 討 論

硬蜱是家畜一種常見的體表寄生蟲，也是一種媒介生物。本次調(diào)查在廣西14個地市牛、羊場捕獲的硬蜱隸屬1科2屬3種，其中微小扇頭蜱是優(yōu)勢種，硬蜱在廣西分布廣，每個季節(jié)均可感染。散養(yǎng)戶比規(guī)模場陽性率高，牛場比羊場陽性率高。硬蜱近幾年因咬人而發(fā)生傳染病事件，使防控硬蜱知識在養(yǎng)殖戶得到普及和重視，規(guī)?；B(yǎng)殖場通過藥浴或注射殺蟲藥進(jìn)行定期殺蟲防控硬蜱。走訪入戶采集蜱蟲得知羊喜食綠葉植物，而一些地區(qū)的綠葉植物具有驅(qū)蟲的效果，因此，一些地區(qū)羊場帶蟲率相對較低。藥物防控硬蜱有一定的成效，但硬蜱繁殖能力強(qiáng)、周期短、對環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)，因此防控硬蜱是一項長期艱巨的任務(wù)。

16S rDNA、COI是線粒體基因組成部分，是鑒定蜱的有效基因，本次運用16S rDNA用于分析廣西微小扇頭蜱、長角血蜱、具角血蜱種屬關(guān)系。16S rDNA進(jìn)化樹顯示的各屬間系統(tǒng)關(guān)系：扇頭蜱屬、革蜱屬、離眼蜱屬聚為一類，又與血蜱屬聚為一類，而廣西各地區(qū)的微小扇頭蜱、長角血蜱、具角血蜱各與參靠序列同處于大分支中。16S rDNA序列含有信息位點較多，引物可擴(kuò)增的物種范圍廣[4-5]，適合用于種屬關(guān)系的分析。而COI基因的進(jìn)化速率較16S rDNA快，且COI基因中插入與缺失情況較少[6-7]，因此選取GenBank公布的部分國內(nèi)和國外微小扇頭蜱、長角血蜱、具角血蜱的COI序列分別與廣西對應(yīng)種類進(jìn)行分析，進(jìn)化樹顯示微小扇頭蜱、長角血蜱、具角血蜱形成大分支，而大分支中不同地方的微小扇頭蜱、長角血蜱、具角血蜱又各自形成小分支，顯示地理分布的差異。

中國硬蜱種類豐富共計2科10屬117種[8-9]，采集的方法有動物體表采集法和人工布旗法，采集區(qū)域涉及各種動物體表、自然保護(hù)區(qū)的森林和草地、山區(qū)、邊境地區(qū)等。本次調(diào)查廣西地區(qū)牛羊體表的蜱蟲隸屬1科2屬3種，其中微小扇頭蜱是優(yōu)勢種，而何成為等[10]人在廣西中越邊境地區(qū)捕獲的硬蜱隸屬于1 科4屬7種，優(yōu)勢種為微小牛蜱和粒形硬蜱。亞紅祥等[11]人在滇西橫斷山區(qū)家畜體表蜱類捕獲的硬蜱隸屬1科1屬4種，微小扇頭蜱為優(yōu)勢種。余向華等[12]人在浙江溫州從各類宿主動物體表捕獲硬蜱隸屬1科4屬7種，長角血蜱為優(yōu)勢種。高楊等[13]人在河北承德市塞罕壩自然保護(hù)區(qū)森林、草地、灌叢捕獲的硬蜱隸屬1科2屬2種，其中全溝硬蜱為優(yōu)勢種。劉歡歡[14]收集森林地區(qū)的硬蜱，其中吉林省有3屬4種蜱，黑龍江省有3屬5種蜱，全溝硬蜱是吉林省、黑龍江省共有優(yōu)勢蜱種。韓蓉[15]在青海省捕獲的蜱隸屬1科 3屬7種，青海血蜱是優(yōu)勢種。不同緯度影響硬蜱的種類組成，全面準(zhǔn)確掌握不同地區(qū)不同宿主的硬蜱種類和優(yōu)勢種，監(jiān)測了解攜帶蜱媒傳染病的種類，對當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生預(yù)防蜱媒傳染病起到預(yù)警作用。

利益沖突：無

引用本文格式：周慶安，黃勝斌，莫勝蘭，等. 廣西地區(qū)家畜牛、羊體表硬蜱情況調(diào)查及種類鑒定[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(11)：1039-1044. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.143