陳雙雙, 代小偉, 田麗麗, 楊新宇, 趙琰楓, 陳 昊, 易俊莉, 張紅偉, 王嫩寒, 李傳友, 丁北川

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)估算，2019年我國(guó)利福平耐藥結(jié)核病患者數(shù)為6.5萬例，占全球利福平耐藥患者數(shù)的14%，位居全球第2位[1]。耐多藥或利福平耐藥結(jié)核病(multidrug/rifampicin-resistant tuberculosis，MDR/RR-TB)傳播時(shí)間長(zhǎng)、治愈率低、病死率高，給結(jié)核病控制帶來極大的挑戰(zhàn)[2]。近年來肺結(jié)核發(fā)病率位居北京市乙類傳染病的首位，是首都重點(diǎn)防治的重大傳染病，其中MDR/RR-TB的防治是我市乃至全國(guó)結(jié)核病控制的難點(diǎn)和重點(diǎn)問題。

根據(jù)《“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃》要求，為進(jìn)一步提高耐藥肺結(jié)核患者的發(fā)現(xiàn)、治療和管理水平，北京市開展所有病原學(xué)陽性肺結(jié)核患者的耐藥篩查工作(具體篩查流程見圖1)。為了解2019年北京市耐藥結(jié)核病篩查方案實(shí)施以來的效果，及RR-TB患者對(duì)其他抗結(jié)核藥物的耐藥情況，以便進(jìn)一步完善耐藥結(jié)核病的快速篩查流程，本文對(duì)2019年北京市結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)及定點(diǎn)醫(yī)院所有的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)臨床分離株進(jìn)行比例法藥物敏感性試驗(yàn)，從而為今后耐藥結(jié)核病防治策略及治療方案提供理論基礎(chǔ)。

圖1 北京市利福平耐藥肺結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)流程Fig.1 Identification process of patients with RR-TB in Beijing

1 材料與方法

1.1 資料來源 搜集北京市結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)及定點(diǎn)醫(yī)院2019年1月至12月可疑肺結(jié)核病患者臨床標(biāo)本中分離的MTB 1 174株，進(jìn)行3種抗結(jié)核藥物[利福平(RFP)、異煙肼(INH)、左氧氟沙星(LFX)]的比例法藥敏試驗(yàn)，篩選出RFP耐藥株進(jìn)行研究分析。采用回顧性研究的方法，分析RFP耐藥的86株MTB對(duì)應(yīng)的86例RR-TB患者診療實(shí)踐過程中耐藥篩查Xpert試驗(yàn)、Hain檢測(cè)及比例法藥敏試驗(yàn)的執(zhí)行情況。所有菌株均經(jīng)抗酸染色及PNB/TCH方法鑒定為MTB，同一例患者有多個(gè)樣本時(shí)，只選取第1個(gè)樣本進(jìn)行試驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) WS 196-2017[3]所有結(jié)核病患者，分為初治和復(fù)治。1)初治結(jié)核病患者：指初次發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核且未接受抗結(jié)核藥物治療，或不規(guī)則抗結(jié)核治療療程<1個(gè)月的患者。2)復(fù)治患者：指不規(guī)則抗結(jié)核治療≥1個(gè)月，或初治失敗和復(fù)發(fā)的患者。3)按照《北京市耐藥結(jié)核病的快速篩查流程》所有肺結(jié)核疑似病人(包括Xpert陰性培養(yǎng)陽性病人)，均需進(jìn)行RFP耐藥篩查, 本文中漏診率是指：按照本研究比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果得到的利福平耐藥病人在臨床診療中未被判定為RFP耐藥的比例；漏篩率是指按照本研究比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果得到的利福平耐藥病人在診療過程中未進(jìn)行RFP耐藥篩查的比例。

1.2 儀器與試劑 GeneXpert技術(shù)反應(yīng)盒及樣品試劑均購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司。GenoType MTBDRplus ver 1.0試劑盒及GT-Blot 48雜交儀均購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。所有改良羅氏培養(yǎng)基均購(gòu)自河南賽諾特生物技術(shù)有限公司。

1.3 基因Xpert檢測(cè)試驗(yàn) Xpert檢測(cè)參照產(chǎn)品說明書，將2 mL痰液根據(jù)標(biāo)本性狀加入1～2倍體積前處理液消化后放入檢測(cè)試劑盒，由儀器2 h內(nèi)自動(dòng)報(bào)告是否檢出MTB，以及利福平是否耐藥。

1.4 線性探針MTBDRplus(簡(jiǎn)稱Hain)檢測(cè)試驗(yàn) 采用超聲裂解法提取陽性培養(yǎng)物中的MTB-DNA。取5 μL提取后的DNA加入45 μL擴(kuò)增混合物，按照說明書的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后取20 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交過程包括化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥情況的判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn)：27個(gè)反應(yīng)條帶中，所有野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時(shí)為敏感；野生條帶缺失不顯色或突變條帶顯色為耐藥。

1.5 比例法藥物敏感性試驗(yàn) 參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]培養(yǎng)陽性菌株均采用比例法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥物濃度分別為INH(0.20 μg/mL)，RFP(40 μg/mL)，LFX(2 μg/mL)，對(duì)照培養(yǎng)基為中性改良羅氏培養(yǎng)基。 耐藥百分比(%)=(含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)/ 對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù))×100%。耐藥判定標(biāo)準(zhǔn):若耐藥百分比≥1% 時(shí)判定為耐藥，<1%判定為敏感。

1.6 質(zhì)量控制 每批藥敏試驗(yàn)均利用標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進(jìn)行質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)室每年參加中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的藥敏試驗(yàn)熟練度測(cè)試，成績(jī)均為優(yōu)秀。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和整理，SPSS 19．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩種檢驗(yàn)方法的一致率=(觀察符合例數(shù)/觀察總例數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1 培陽患者耐藥篩查基本情況 2019年1-12月北京市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)共分離MTB 1 174株，全部進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)篩出利福平耐藥株為86株，利福平耐藥率為7.33%(86/1 174)，其中初治患者為80.23%(69/86)。耐多藥結(jié)核病(multidrug—resistant tuberculosis，MDR-TB)患者的分離株為64株，2019年北京市MTB耐多藥率為5.45%(64/1 174)。

比例法藥敏試驗(yàn)中利福平耐藥株對(duì)應(yīng)的86位患者Xpert試驗(yàn)及結(jié)果如表1， Xpert陽性病例與表型藥敏試驗(yàn)利福平耐藥檢出的一致率為88.57%(62/70)，初復(fù)治在4組Xpert試驗(yàn)不同情況中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.50，P>0.05)。

表1 Xpert試驗(yàn)在表型耐藥RR-TB患者中的分布Tab.1 Distribution of Xpert test in patients with phenotype-resistant RR-TB

按照北京市耐藥篩查流程，16例MTB分離培養(yǎng)陽性且Xpert試驗(yàn)結(jié)果為陰性或未進(jìn)行Xpert試驗(yàn)，應(yīng)取分離培養(yǎng)的MTB菌株進(jìn)行快速Hain試驗(yàn)以補(bǔ)充篩查利福平耐藥情況，其中有3例患者進(jìn)行了Hain試驗(yàn)且結(jié)果為利福平耐藥，86例RR-TB中經(jīng)Xpert和Hain兩種分子生物學(xué)方法快速篩查出65例，2例Xpert陰性和1例無Xpert結(jié)果后期培養(yǎng)陽性患者，取培養(yǎng)物進(jìn)行了表型藥敏試驗(yàn)，剩余10例未進(jìn)行任何分子和表型方法的臨床藥敏篩查，漏篩率為11.63%(10/86)，詳情見表2。2019年全年經(jīng)耐藥篩查工作發(fā)現(xiàn)RR-TB 68例，8例Xpert為利福平敏感而表型藥敏為利福平耐藥，以比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，通過耐藥篩查工作RR-TB患者發(fā)現(xiàn)率為79.07%(68/86)，其中分子生物學(xué)方法RR-TB患者發(fā)現(xiàn)率為75.58%(65/86)，漏診率為20.93%(18/86)。

表2 Xpert試驗(yàn)陰性及未進(jìn)行Xpert試驗(yàn)的RR-TB中耐藥篩查情況Tab.2 Screening of drug resistance in RR-TB with negative Xpert test and without Xpert test

2.2 MTB耐藥性檢測(cè)結(jié)果分析 1 174株MTB中比例法藥敏檢測(cè)肼耐藥為144株，MDR為64株，異煙肼耐藥菌株中MDR為44.44%，RR中MDR為74.42%。RR耐藥株中MDR比例明顯高于異煙肼耐藥株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.04，P<0.05)。

以表型藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)2021年WHO最新發(fā)布的準(zhǔn)廣泛耐藥(pre-extensive drug resistance tuberculosis，pre-XDR-TB)的新定義，符合MDR/RR-TB外，同時(shí)對(duì)任意氟喹諾酮類藥品(包括左氧氟沙星、莫西沙星)耐藥。86株RR臨床分離株中LFX耐藥為20株，準(zhǔn)廣泛耐藥率為1.70%(20/1174)，在RR-TB中準(zhǔn)廣泛耐藥率為23.26%(20/86)。初復(fù)治在3種不同耐藥類型中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.02，P>0.05)，見表3。

表3 不同耐藥類型的分布情況Tab.3 Distribution of different resistance types

3 討 論

北京市結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)及定點(diǎn)醫(yī)院2019年利福平耐藥株占全年MTB的7.33%，較2009年的9.5%[5]有所下降，遠(yuǎn)低于吉林省的17.23%[6]，這與上海地區(qū)相似[7]，說明我市RR-TB耐藥狀況處于較低水平且逐步改善。這可能與我市2011年起對(duì)疑似耐多藥患者進(jìn)行免費(fèi)一二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)，從而制定針對(duì)性的治療方案有關(guān)。

表型藥敏耐藥的86例RR-TB患者中，Xpert陽性檢出MTB為70例，其中利福平耐藥為62例，兩方法利福平耐藥檢出的一致率為88.57%，高于廣東地區(qū)報(bào)道的利福平耐藥株rpoB的突變率81.5%[8]，低于國(guó)內(nèi)外眾多報(bào)道的90%～95%的突變率[9]。Xpert檢測(cè)直接使用原始臨床標(biāo)本未分離培養(yǎng)，而分子生物學(xué)方法直接檢測(cè)臨床標(biāo)本需耐藥MTB含量高于20%以上才能檢出[10-11]，而藥敏試驗(yàn)為培養(yǎng)陽性的菌株，因此造成部分耐藥MTB的漏檢。本研究中有8例表型藥敏結(jié)果為耐藥而Xpert檢測(cè)為敏感。有研究表明，rpoB基因RRDR區(qū)外存在影響MTB對(duì)利福平耐藥的其他未知機(jī)制或者非ropB基因突變引起耐藥[12]。另外，異質(zhì)性耐藥也是導(dǎo)致表型和基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果不符的重要原因[13]。

按照北京市耐藥篩查流程，分離培養(yǎng)陽性且Xpert陰性或未進(jìn)行Xpert試驗(yàn)，應(yīng)使用MTB菌株進(jìn)行Hain試驗(yàn)以補(bǔ)充篩查利福平耐藥情況，以便迅速獲得RFP的耐藥結(jié)果，盡快調(diào)整治療方案，仍有3例未選擇Hain試驗(yàn)而直接進(jìn)行比例法藥敏，由于表型藥敏耗時(shí)長(zhǎng)，在一定程度延誤了耐藥治療方案的調(diào)整。另外10例分枝桿菌培養(yǎng)陽性未經(jīng)過分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)，漏篩率為11.63%。這提示我們各結(jié)防機(jī)構(gòu)及定點(diǎn)醫(yī)院對(duì)耐藥結(jié)核病的重視程度不夠，仍有部分病原學(xué)陽性患者未獲得耐藥結(jié)果，工作落實(shí)層面存在問題。部分結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)及定點(diǎn)醫(yī)院對(duì)耐藥篩查流程熟悉程度不夠，貫徹執(zhí)行力度不足，應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)市區(qū)各結(jié)防機(jī)構(gòu)耐藥篩查的督導(dǎo)與管理，從而進(jìn)一步發(fā)揮Xpert聯(lián)合Hain方法的分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。

2019年通過耐藥篩查檢出RR-TB 68例，通過耐藥篩查工作RR-TB患者發(fā)現(xiàn)率為79.07%，遠(yuǎn)高于同年我國(guó)RR-TB 28.7%的發(fā)現(xiàn)率[14]，但是仍然存在20.93%的漏診率。主要存在技術(shù)層面和工作落實(shí)層面兩方面的原因。首先，在技術(shù)方面存在著表型藥敏與分子生物學(xué)方法結(jié)果不一致現(xiàn)象，另外在耐藥篩查診療過程中工作機(jī)制有待完善，加強(qiáng)區(qū)縣市級(jí)診療人員對(duì)耐藥篩查重要性的認(rèn)知，并定期開展督導(dǎo)檢查。

北京市耐藥篩查工作以Xpert方法為主的分子生物學(xué)快速耐藥檢測(cè)較傳統(tǒng)培養(yǎng)物藥敏試驗(yàn)，對(duì)RR-TB診斷時(shí)間大幅縮短，報(bào)告時(shí)間的中位數(shù)分別為1.0(0.0～7.0) d和 62.5(34.0～94.3) d，大大提高了耐藥結(jié)核病的納入治療率[15-16]。其中通過Xpert試驗(yàn)檢出RR-TB 62例，相比我市2018年以前僅對(duì)疑似耐多藥患者藥敏試驗(yàn)篩查中RR-TB數(shù)量大大增加，其中初治患者占82.26%，說明耐藥MTB的傳播是本市RR-TB的重要來源[17]。因此在北京特大人口城市中，早期開展Xpert檢測(cè)，管理并治愈耐藥結(jié)核病人，從而盡早降低其傳染性是控制耐藥結(jié)核病的根本策略。

RR耐藥株中MDR占74.42%，異煙肼耐藥株中MDR為44.44%，稍低于WHO報(bào)道的新發(fā)耐利福平結(jié)核病中78%為耐多藥[1]。另外本研究顯示RR-TB、MDR-TB、pre-XDR-TB中初復(fù)治比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明無論初治復(fù)治患者一旦檢出利福平耐藥應(yīng)高度懷疑耐多藥。因此建議臨床參考利福平檢測(cè)結(jié)果盡早開展主要抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)，同時(shí)通過診療專家組討論后確定診斷及治療方案，從而大大減低耐藥結(jié)核病的傳播風(fēng)險(xiǎn)。

本研究RR-TB中LFX耐藥株占23.26%，與魏淑貞等人報(bào)道的相似[18]，我國(guó)MDR/RR-TB患者對(duì)氟喹諾酮類藥品的耐藥率約25%，處于較高水平。氟喹諾酮類藥物在MDR/RR-TB治療中具有關(guān)鍵作用，現(xiàn)已作為利福平耐藥肺結(jié)核的核心藥物，若發(fā)生耐藥會(huì)大大降低治療效果，且影響短程和長(zhǎng)程方案的選用[19]。若結(jié)果顯示氟喹諾酮類藥物敏感，優(yōu)先采用短程化療方案；若結(jié)果顯示氟喹諾酮類藥物耐藥，則選用長(zhǎng)療程化療方案治療，后續(xù)再結(jié)合傳統(tǒng)藥敏檢測(cè)結(jié)果調(diào)整化療方案。因此，按照《中國(guó)結(jié)核病預(yù)防控制工作技術(shù)規(guī)范(2020年版)》要求，對(duì)MDR/RR-TB在治療前應(yīng)進(jìn)行氟喹諾酮類藥物的分子藥敏檢測(cè)，以給出精準(zhǔn)治療方案。MDR-TB治療方案中A組藥物貝達(dá)喹啉和利奈唑胺以及B組的氯法齊明較晚應(yīng)用于結(jié)核病的治療，耐藥率較低，本研究對(duì)這3種藥物的耐藥性未涉及。

本研究存在一定的局限性。第一，本研究搜集的結(jié)防系統(tǒng)及定點(diǎn)醫(yī)院就診的患者以初治、病情稍輕、并發(fā)癥較少的患者為主，可能對(duì)所有肺結(jié)核患者的代表性有限。第二，本研究所進(jìn)行的分子檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)，均沒有進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，可能存在系統(tǒng)誤差。第三，由于本研究未開展MTB對(duì)貝達(dá)喹啉、利奈唑胺及氯法齊明藥物的表型藥敏試驗(yàn)，對(duì)長(zhǎng)療程MDR-TB的治療不能提供全面耐藥信息。第四，常用于治療肺結(jié)核的氟喹諾酮類藥物主要包括LFX及莫西沙星(MFX)，本研究未進(jìn)行MFX藥敏試驗(yàn)，可能實(shí)際pre-XDR-TB的發(fā)病數(shù)稍高于現(xiàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)。

綜上所述，我市實(shí)施分子生物學(xué)方法為主的耐藥篩查以來，RR-TB的發(fā)現(xiàn)顯著增多，但仍有一定的漏篩率，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)管理和督促，以盡早降低MDR/RR-TB的傳染性。另外，我市應(yīng)盡早開展氟喹諾酮類藥物的分子藥敏檢測(cè)，為耐藥結(jié)核病的治療提供精準(zhǔn)的化療方案。

利益沖突：無

引用本文格式：陳雙雙, 代小偉, 田麗麗, 等. 北京市肺結(jié)核病人耐藥篩查實(shí)施效果的研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：1018-1022. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.152