唐愛明，陳智，譚丹，鄭姣妹，王輝，羅湘，賴詩(shī)嘉，劉增再，王洪亮

（長(zhǎng)沙市動(dòng)植物疫病預(yù)防控制中心 長(zhǎng)沙 410007）

高致病性禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）、雞新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）、禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）、雞白?。╬ullorum disease，PD）、禽巴氏桿菌（pasteurella multocida，PM）是近年來規(guī)模種雞場(chǎng)國(guó)家中長(zhǎng)期計(jì)劃重點(diǎn)監(jiān)測(cè)和凈化的疫病病原[1]。

為推動(dòng)養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，減少禽白血病等主要疫病對(duì)種禽養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)損失，提供優(yōu)質(zhì)禽肉及其產(chǎn)品[2]，建設(shè)長(zhǎng)沙食品安全城市，規(guī)?；N雞場(chǎng)在結(jié)合自身實(shí)際的前提下，盡可能凈化更多病種，以最大限度提升動(dòng)物健康指標(biāo)，增強(qiáng)經(jīng)濟(jì)效益。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《規(guī)?；N禽場(chǎng)主要疫病凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)》[3]，結(jié)合2018—2021 年《湖南省動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》，長(zhǎng)沙市動(dòng)植物疫病預(yù)防控制中心在長(zhǎng)沙地區(qū)部分商品化種雞場(chǎng)，開展禽流感、新城疫、禽白血病、雞白痢、禽巴氏桿菌病等主要疫病的血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估、分析，為長(zhǎng)沙市種禽場(chǎng)主要疫病凈化提供重要的決策依據(jù)[4,5]。

1 材料與方法

1.1 材料

2018—2021 年，中心實(shí)驗(yàn)室在每年春防秋防、冬春季流感監(jiān)測(cè)、日常監(jiān)測(cè)采樣時(shí)，按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)局規(guī)?；N禽場(chǎng)主要疫病凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)抽樣方案，抽樣數(shù)量按照無疫證明公式計(jì)算：血清學(xué)按照每個(gè)場(chǎng)抗體陽性率90%，可接受誤差5%，置信度95%，期望90%，誤差10%，隨機(jī)抽樣；病原學(xué)按照置信度95%，預(yù)期流行率1%，隨機(jī)抽樣，覆蓋不同棟種雞群，按國(guó)家規(guī)定采集種雞蛋、雞血、咽喉和泄殖腔拭子，每個(gè)種雞場(chǎng)根據(jù)飼養(yǎng)數(shù)量采集不同類型樣品40～50 份，雞蛋、雞血和雞拭子一一對(duì)應(yīng)，抽檢27 周齡以上種雞，共采集2,700 份樣品[6]。

1.2 試劑

血清學(xué)試劑：H5/H7 亞型AIV 血凝抑制試驗(yàn)抗原、AIVH5/H7陽性血清（AIVH5Re-11 株、AIVH5Re-12 株、AIVH7Re-2 株、AIVH7Re-3 株），購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；ND 血凝抑制試驗(yàn)抗原、ND 陽性血清，哈爾濱國(guó)生生物公司生產(chǎn)。

ELISA 試劑：ALV 病毒ELISA 抗原檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物公司和北京愛德士元亨生物公司[7]。

PD 平板凝集試驗(yàn)抗原、PD 陽性血清，購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物公司。

病原學(xué)試劑：禽流感AIV H5/H7 核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）、新城疫ND 核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）、禽巴氏桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法），購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因公司；核酸提取試劑盒：購(gòu)自西安天隆公司。

PM 鑒定：5%雞血清葡萄糖淀粉瓊脂培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑公司；GN 革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡，法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、MK3 酶標(biāo)儀、西安天隆N968 核酸提取儀、羅氏Roche LightCycler480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、法國(guó)梅里埃全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)。

1.4 方法

AIV、ND 免疫抗體檢測(cè)采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)，AIV、ND 病原檢測(cè)采用熒光RT-PCR 方法；PD 感染抗體檢測(cè)采用全血平板凝集試驗(yàn)；ALVP27 抗原檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，PM 病原檢測(cè)采用熒光RT-PCR 方法和細(xì)菌鑒定。具體檢測(cè)病種、樣品類型、檢測(cè)依據(jù)及檢測(cè)方法見表1。

表1 檢測(cè)項(xiàng)目及其方法

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

禽流感、新城疫免疫抗體結(jié)果判定：依據(jù)GB/T 18936-2020 和GB/T 16550—2020 最新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，HI 效價(jià)≥4log2 判為雞血清抗體效價(jià)陽性。根據(jù)湖南省多年的疫病監(jiān)測(cè)要求，禽流感、新城疫經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)（HI）檢測(cè)，對(duì)滅活疫苗免疫的家禽，免疫21d 后HI抗體效價(jià)≥4log2 為免疫合格。

雞白痢感染抗體結(jié)果判定：按照NY/T 536—2017 農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，50%（++）以上凝集，出現(xiàn)明顯的紫色凝集顆粒，反應(yīng)液較為混濁為陽性，其余均為陰性。

禽白血病P27 抗原ELISA 檢測(cè)，禽流感、新城疫、禽巴氏桿菌熒光PCR 病原檢測(cè)，禽巴氏桿菌細(xì)菌鑒定，均按照檢測(cè)試劑盒提供的說明書進(jìn)行結(jié)果判定和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 禽流感、新城疫免疫抗體監(jiān)測(cè)

2018—2021 年長(zhǎng)沙部分規(guī)模種雞場(chǎng)血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2 可以看出，4 年共對(duì)長(zhǎng)沙市5 個(gè)種雞場(chǎng)900 份雞血清樣品進(jìn)行AIV H5、AIV H7、ND 免疫抗體監(jiān)測(cè)，抗體合格率分別為98.8%、98.8%、99.8%，種雞場(chǎng)禽流感、新城疫免疫抗體水平在95%以上，均達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)模化種禽場(chǎng)抗體合格率90%以上的免疫凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，表明種雞場(chǎng)3 種病原的抗體保護(hù)水平較高。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，一定要確保1%的紅細(xì)胞配制準(zhǔn)確，控制好反應(yīng)溫度和作用時(shí)間，同時(shí)做4、2、1、0.5、0.25 和0.12HAU 抗原的回滴實(shí)驗(yàn)，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

表2 種雞場(chǎng)禽流感、新城疫免疫抗體檢測(cè)結(jié)果匯總表

2.2 病原學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果

1）不同年份病原感染情況2018—2021 年，5 個(gè)種雞場(chǎng)均未檢測(cè)到AIV H5、AIV H7、NDV 核酸陽性，說明禽流感、新城疫基本達(dá)到了無疫狀況；2018—2021 年，部分種雞場(chǎng)檢測(cè)到ALV、PD 病原學(xué)陽性，分別在2018 年和2020 年，結(jié)果見表3 和表4，個(gè)體陽性率分別為0.78%、0.44%；2018—2021 年，5 個(gè)種雞場(chǎng)均未檢測(cè)到PM 核酸陽性。所有種雞場(chǎng)，只要檢測(cè)到AIV、NDV、ALV、PD、PM 病原學(xué)陽性個(gè)體，均應(yīng)及時(shí)進(jìn)行淘汰，同籠雞可選擇出售，不再作為繁育留種個(gè)體。

表3 5個(gè)種雞場(chǎng)連續(xù)4年的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果匯總表

表4 2018-2021年種雞場(chǎng)病原學(xué)陽性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2）不同病原感染情況2018—2021 年長(zhǎng)沙部分規(guī)模種雞場(chǎng)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果匯總，見表5。由表5 可以看出，4 年共對(duì)長(zhǎng)沙市5 個(gè)種雞場(chǎng)雞咽喉/泄殖腔拭子樣品進(jìn)行禽流感H5、禽流感H7、雞新城疫、禽巴氏桿菌病毒核酸監(jiān)測(cè)，病原學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果均為陰性。禽白血病、雞白痢在2018 年和2020 年均檢測(cè)到陽性。

表5 種雞場(chǎng)病原學(xué)陽性場(chǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3）不同種雞場(chǎng)感染情況5 個(gè)種雞場(chǎng)連續(xù)4 年的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表6，結(jié)果顯示：A 場(chǎng)AIV、NDV、PD、PM 病原學(xué)連續(xù)4 年保持陰性，ALV 偶有檢出，分別為1.2%和0.8%陽性率，出現(xiàn)陽性雞只，及時(shí)采取措施，進(jìn)行淘汰凈化；B 場(chǎng)連續(xù)4年AIV、NDV、ALV、PD、PM 病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為陰性；C 場(chǎng)AIV、NDV、ALV、PM 病原學(xué)連續(xù)4 年保持陰性，PD 在2018年和2020 年檢出陽性，陽性率分別為1.9%和1.6%，淘汰陽性個(gè)體進(jìn)行凈化，2021 年P(guān)D 抽檢結(jié)果為陰性；D 場(chǎng)AIV、NDV、PD、PM 病原學(xué)連續(xù)4 年保持陰性，2018 年和2020 年檢出ALV 陽性，陽性率分別為1.5%和0.5%，2019 年和2021年未檢出ALV 陽性；E 場(chǎng)AIV、NVD、ALV、PD、PM 病原學(xué)連續(xù)4 年均保持陰性。

表6 5個(gè)種雞場(chǎng)連續(xù)4年的病原學(xué)陽性率統(tǒng)計(jì)（%）

3 討論

3.1 禽流感

長(zhǎng)沙市在提升動(dòng)物疫病防控能力方面，措施得力，每年主動(dòng)開展春秋防禽流感病原和血清學(xué)監(jiān)測(cè)，冬春季禽流感專項(xiàng)監(jiān)測(cè)，全面開展流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)禽流感陽性場(chǎng)點(diǎn)，及時(shí)采取應(yīng)對(duì)措施。禽流感是國(guó)家強(qiáng)制免疫的三大病種之一，長(zhǎng)沙地區(qū)規(guī)模養(yǎng)禽場(chǎng)強(qiáng)制免疫疫苗資金直接補(bǔ)貼試點(diǎn)穩(wěn)步推進(jìn)，整體免疫到位[8]。本次監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)沙市5 個(gè)種雞場(chǎng)AIV5/H7 核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性，且每年免疫抗體平均在97.6%以上，免疫效果良好。

3.2 新城疫

湖南省市兩級(jí)科學(xué)制定免疫程序，開展新城疫免疫抗體監(jiān)測(cè)，在種雞場(chǎng)群體免疫評(píng)估工作中發(fā)揮了重要作用。長(zhǎng)沙地區(qū)商品化種雞場(chǎng)大多使用某知名品牌禽流感、新城疫、支氣管炎、減蛋綜合征四聯(lián)苗免疫，免疫效果好，2018—2021 年5 個(gè)種雞場(chǎng)新城疫免疫抗體平均在99.5%以上，基本做到免疫無疫。

3.3 禽白血病

近年來，長(zhǎng)沙市持續(xù)開展種禽場(chǎng)禽白血病等主要疫病防控與凈化技術(shù)研究[9]，按照國(guó)家疫控中心2020 年種雞場(chǎng)主要垂直傳播性疫病凈化要求，開展凈化工作，積極探索商品化種雞場(chǎng)禽白血病凈化技術(shù)規(guī)范。2018—2021 年5 個(gè)種雞場(chǎng)禽白血病監(jiān)測(cè)，種蛋和咽喉泄殖腔棉拭子偶有陽性檢出，發(fā)現(xiàn)陽性個(gè)體，及時(shí)采取措施，進(jìn)行淘汰，逐步凈化，爭(zhēng)取創(chuàng)建幾家禽白血病凈化示范場(chǎng)，培育優(yōu)質(zhì)生態(tài)種禽養(yǎng)殖企業(yè)，打造從農(nóng)場(chǎng)到餐桌的綠色家禽產(chǎn)品品牌，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，向國(guó)家相關(guān)部門提供決策支持。

3.4 雞白痢

雞白痢凈化是一項(xiàng)長(zhǎng)期持久的工作，雞白痢可以水平和垂直兩種方式進(jìn)行傳播。長(zhǎng)沙市持續(xù)開展雞白痢凈化工作，在春秋防免疫效果評(píng)估和冬春季禽流感血清學(xué)監(jiān)測(cè)時(shí)，進(jìn)行雞白痢感染抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，規(guī)模種雞場(chǎng)陽性極少，偶有個(gè)例發(fā)生，相關(guān)雞場(chǎng)立即淘汰陽性雞，對(duì)全場(chǎng)環(huán)境進(jìn)行消毒，嚴(yán)格生物安全操作。同時(shí)對(duì)陽性雞群加大監(jiān)測(cè)力度，檢測(cè)，陽性淘汰，再檢測(cè)，陽性淘汰，消毒，直至達(dá)到國(guó)家疫控中心凈化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

3.5 禽巴氏桿菌病

禽巴氏桿菌病即禽霍亂，為養(yǎng)禽場(chǎng)常見細(xì)菌性疾病。禽巴氏桿菌為條件致病菌，當(dāng)禽舍通風(fēng)狀況良好，平時(shí)防疫措施包括免疫接種、定期消毒、驅(qū)蚊滅鼠等措施到位時(shí)，基本不會(huì)發(fā)病。規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)最好配備專業(yè)獸醫(yī)技術(shù)人員進(jìn)行飼養(yǎng)管理，定期做好雞群免疫，發(fā)現(xiàn)可疑病例，及時(shí)采取措施，早診斷，早治療，科學(xué)用藥，減少經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)沙地區(qū)5 個(gè)規(guī)模種雞場(chǎng)連續(xù)4 年來暫未監(jiān)測(cè)到禽巴氏桿菌病陽性。

4 結(jié)論

對(duì)長(zhǎng)沙地區(qū)5 個(gè)大型商品化種雞場(chǎng)連續(xù)4 年對(duì)5 個(gè)動(dòng)物病種的監(jiān)測(cè)表明：各個(gè)種雞場(chǎng)禽流感、新城疫、禽巴氏桿菌得到了有效控制，基本達(dá)到國(guó)家疫控中心凈化評(píng)估要求。而部分種雞場(chǎng)偶有禽白血病、雞白痢感染，需通過檢測(cè)，陽性淘汰，再檢測(cè)，消毒，通過綜合防控和凈化措施，減少甚至根除種禽場(chǎng)禽白血病和雞白痢，改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，提高生態(tài)效益，力爭(zhēng)創(chuàng)建幾家禽白血病和雞白痢等主要疫病凈化示范場(chǎng)[10]。