李 冰，陳 靖，于素香，朱鳳池，閆江鶴，趙秀娟，馮 璞，陳苗鳳，賈金娜

結(jié)腸腺癌是結(jié)腸癌中最常見的一種亞型，由于缺乏顯著的早期癥狀，多數(shù)患者在就診時(shí)已處于進(jìn)展期[1]。進(jìn)展期結(jié)腸腺癌具有高侵襲性，導(dǎo)致結(jié)腸腺癌患者的死亡率升高[2-3]。目前結(jié)腸腺癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、放化療及聯(lián)合治療等，盡管取得一定進(jìn)展，但仍然難以滿足多數(shù)進(jìn)展期患者的生存需求。多個(gè)針對結(jié)腸腺癌的分子靶點(diǎn)如SIRT6、CXCR2等相繼被發(fā)現(xiàn)[4-5]。Kinesin家族成員C1（kinesin family member C1,KIFC1）也稱作HSET，是Kinesin超家族的一個(gè)馬達(dá)蛋白[6]。近年來，KIFC1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用被越來越多地揭示出來[7-9]。由于KIFC1在癌細(xì)胞的多個(gè)中心體聚集中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此已被認(rèn)為是一個(gè)潛在的化療靶點(diǎn)。此外，KIFC1也被發(fā)現(xiàn)通過穩(wěn)定一定程度的遺傳不穩(wěn)定性、延遲細(xì)胞周期和保護(hù)癌細(xì)胞存活信號，主動驅(qū)動腫瘤的惡性和轉(zhuǎn)移[10-12]。然而，KIFC1是否可影響結(jié)腸癌的發(fā)展仍然未知。本研究主要探討KIFC1在結(jié)腸癌組織樣本中的表達(dá)和臨床意義，并利用短發(fā)夾RNA（shRNA）敲低結(jié)腸腺癌細(xì)胞系KIFC1的表達(dá)，評估KIFC1調(diào)控結(jié)腸腺癌細(xì)胞增殖能力的作用，以期為基于KIFC1的靶向治療提供臨床和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取來自保定市第四中心醫(yī)院、天津市腫瘤醫(yī)院和保定第二醫(yī)院的結(jié)腸腺癌手術(shù)治療患者122例，其中男性66例，女性56例；年齡42～78歲，平均53.2歲；臨床分期I～I(xiàn)I期68例，III～I(xiàn)V期54例；腫瘤病理高分化78例，低分化44例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例，術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)腸腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)為有病理證實(shí)并非結(jié)腸腺癌、存在第二原發(fā)腫瘤、存在全身廣泛轉(zhuǎn)移或存在手術(shù)切除禁忌等。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 試劑：Anti-KIFC1抗體（ab172620，美國Abcam公司）；抗核抗體（1:1000稀釋，中國Sanying公司）；二氨基苯胺（中國上海Cell Signaling科技公司）；胎牛血清（04-100-1ACS，以色列 BI公司）；Lipofectamine 2000（11668069，美 國 Invitrogen公 司 ）；MTT（298931）、DMSO（67685）、結(jié)晶紫（548629）均購自美國Sigma公司；Trizol試劑（15596026，美國Invitrogen公司），第一鏈cDNA合成試劑盒（K1621，美國Thermo公司），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（ROX）（瑞士羅氏公司）；β-肌動蛋白（ab179467，1:1000，美國Abcam公司）。本試驗(yàn)中涉及的儀器如下：ABI 7900HT QPCR Cycle，微板閱讀器（美國Thermo 公司），PVDF膜（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）。細(xì)胞系：結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29（國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺，北京）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及評分標(biāo)準(zhǔn) 采用免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)檢測KIFC1在結(jié)腸腺癌患者的腫瘤組織及其對應(yīng)的癌旁組織（距離腫瘤組織3～5 mm的結(jié)腸正常組織）中的表達(dá)水平。用福爾馬林固定腫瘤組織，行石蠟包埋與切片后，于75 ℃加熱30 min，用二甲苯脫蠟，并用梯度乙醇（100%、100%、95%、85%、75%）水合。用檸檬酸緩沖液孵育15 min提取抗原，并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶5 min，5% BSA封閉切片20 min，隨后使用抗KIFC1的抗體（1︰100稀釋）孵育2 h，生物素化的二抗（1︰1000稀釋）孵育1.5 h，二氨基苯胺作為顯色劑底物，洗滌染色5 min后用顯微鏡采集圖像。評分標(biāo)準(zhǔn)如下[8]：陽性細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞陽性率<5%記為0分，腫瘤細(xì)胞陽性率5%～25%記為1分，腫瘤細(xì)胞陽性率25%～75%記為2分，腫瘤細(xì)胞陽性率>75%記為3分。同時(shí)對陽性染色的腫瘤細(xì)胞膜及胞漿染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：陰性染色記為0分，弱陽性染色記為1分，中度陽性染色記為2分，強(qiáng)陽性染色記為3分。隨后將陽性細(xì)胞百分比評分和染色強(qiáng)度評分相加，分為高表達(dá)（3～6分）和低表達(dá)（0～3分）。每個(gè)患者的腫瘤組織切片選取5個(gè)視野觀察。最終結(jié)果采用雙盲法進(jìn)行判斷。

1.4 細(xì)胞系培養(yǎng)并利用shRNA敲低KIFC1 將結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，孵育于二氧化碳濃度為5%，溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞種植在24孔板上，使用shRNA（序列AAATTACCACATCCCACCCAAGA） 感 染HCT116和HT29細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000，將50 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到培養(yǎng)基中，混合均勻，轉(zhuǎn)染后12 h觀察細(xì)胞形態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)Trizol試劑從轉(zhuǎn)染KIFC1 shRNA的HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞中提取總RNA，用第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA，使用ABI 7900HT QPCR Cycle和 FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。GAPDH已經(jīng)被規(guī)范化，并使用2-??Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。β-actin引物：5’-CAGCTCACCATGGATGATGATATC-3’和 5’-AAGCCGGCCTTGCACAT-3’，KIFC1 引物：5’-TGAGCAACAAGGAGTCCCAC-3’ 和5’-TCACTTCCTGTTGGCCTGAG-3’。

1.6 Western blotting 用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞以提取總蛋白，用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（PC0020，中國索萊寶公司）定量。將20 μg蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜。之后用溶于TBST緩沖液中的5%脫脂牛奶封閉膜1 h，在4 ℃下與一抗（KIFC1、PCNA、Ki67、β-actin）孵育過夜。然后使用TBST緩沖液洗滌3次，與特異性的HRP結(jié)合的二抗孵育，滴加顯影液在曝光儀中進(jìn)行檢測。結(jié)果用相對表達(dá)量進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 MTT實(shí)驗(yàn) 對照組和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞以每孔5000個(gè)的密度接種于96孔板中，72 h后添加10 μL濃度為5 mg/mL的MTT培養(yǎng)6 h。抽吸培養(yǎng)基并將MTT溶解于100 μL DMSO中，使用酶標(biāo)儀在570 nm處讀取吸光度。

1.8 克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h計(jì)數(shù)，并以每孔300個(gè)細(xì)胞的密度分3次接種到6孔板中，然后培養(yǎng)8 d。培養(yǎng)基每4天更換1次，然后用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的菌落。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)比較不同臨床病理特征患者KIFC1蛋白表達(dá)情況的差異。劑量資料以（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)。利用Kaplan-Meier方法比較KIFC1低表達(dá)與高表達(dá)結(jié)腸腺癌患者的總生存期和無病生存期。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIFC1在結(jié)腸腺癌組織樣本中高表達(dá) KIFC1主要定位在結(jié)腸腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，相對于癌旁組織，KIFC1在結(jié)腸腺癌中呈明顯高表達(dá)，見圖1。

圖1 KIFC1在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況比較（免疫組織化學(xué)法，上圖為×100，下圖為×200）

2.2 KIFC1與結(jié)腸腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)KIFC1的染色強(qiáng)度，將結(jié)腸癌患者的腫瘤組織樣本分為KIFC1高表達(dá)組（60例）和KIFC1低表達(dá)組（62例），比較兩組結(jié)腸腺癌患者的臨床特征發(fā)現(xiàn)，KIFC1的表達(dá)水平與結(jié)腸腺癌患者的腫瘤T分期及臨床分期緊密相關(guān)，高表達(dá)組的T3～4期和III～I(xiàn)V期患者比例高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而兩組其他臨床特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 122例結(jié)腸癌組織中KIFC1高表達(dá)組和低表達(dá)組的臨床病理特征比較

2.3 KIFC1表達(dá)水平與結(jié)腸腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān) 高表達(dá)KIFC1組結(jié)腸腺癌患者具有更低的總生存期及無進(jìn)展生存期（χ2=12.510、21.561，P=0.0007、P<0.0001， 圖 2）， 表 明KIFC1的表達(dá)水平與結(jié)腸腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示KIFC1可能在結(jié)腸腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

圖2 KIFC1的表達(dá)水平與結(jié)腸腺癌患者總生存期和無進(jìn)展生存期的相關(guān)性

2.4 敲低結(jié)腸癌細(xì)胞中KIFC1表達(dá)水平抑制其增殖能力 使用shKIFC1慢病毒載體感染HCT116和HT29細(xì)胞后，通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting驗(yàn)證其在基因和蛋白水平敲低KIFC1的效率，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞HCT116和HT29被shKIFC1慢病毒感染后，KIFC1基因和蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖3）。隨后，利用MTT實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，接種細(xì)胞72 h后，對比對照組，敲低KIFC1組細(xì)胞增殖明顯下降。為進(jìn)一步證明KIFC1能否調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力，本研究檢測了增殖的標(biāo)志物Ki67和PCNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)無論是集落形成數(shù)還是增殖標(biāo)志物的表達(dá)量，敲低KIFC1后，均明顯下降（圖4）。

圖3 shRNA轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞后KIFC1基因mRNA（A）和蛋白（B）表達(dá)水平降低

圖4 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中敲低KIFC1表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

結(jié)腸腺癌是一種高發(fā)病率及高死亡率的惡性腫瘤[3]。由于缺乏顯著的早期癥狀及高轉(zhuǎn)移性，現(xiàn)有的治療手段，如放療、化療等均難以起到預(yù)期的治療效果[1]。近年來靶向治療受到更多關(guān)注，多個(gè)結(jié)腸腺癌靶向治療藥物被發(fā)現(xiàn)，少數(shù)已處于臨床實(shí)驗(yàn)階段[13]。本研究發(fā)現(xiàn)KIFC1在結(jié)腸腺癌組織中呈高表達(dá)，并且與結(jié)腸腺癌患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)，提示其在結(jié)腸腺癌發(fā)展過程中可能具有重要作用。近年來，KIFC1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用被越來越多地揭示出來：多篇文獻(xiàn)證實(shí)KIFC1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并與其不良預(yù)后有關(guān)[9-11]。KIFC1影響非小細(xì)胞肺癌及腎細(xì)胞癌的增殖，影響肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后[11]，KIFC1可作為三陰性乳腺癌不良預(yù)后的生物標(biāo)志物[8-10]。有研究報(bào)道，KIFC1可沿著微管并朝向負(fù)末端移動，從而參與貨物轉(zhuǎn)運(yùn)[6]，KIFC1還參與有絲分裂紡錘體的形成及纖毛發(fā)生[7]，可調(diào)控高爾基體的形成、定位及高爾基體相關(guān)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。近年來，KIFC1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用被越來越多地揭示出來：多篇文獻(xiàn)證實(shí)KIFC1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與多中心體的形成有關(guān)[12]，并與不良預(yù)后有關(guān)[10-12]：Han等[9]發(fā)現(xiàn)KIFC1水平升高與肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，KIFC1在體外和體內(nèi)都誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移；且KIFC1過表達(dá)增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞增殖和病灶形成，而KIFC1敲除抑制了肝癌細(xì)胞的生長和病灶形成。本研究發(fā)現(xiàn)KIFC1在結(jié)腸腺癌組織中的高表達(dá)，并且與結(jié)腸腺癌患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)，提示其在結(jié)腸腺癌發(fā)展過程中可能具有重要作用。同時(shí)，本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成功建立的穩(wěn)定敲除KIFC1的細(xì)胞系，對比對照組，其細(xì)胞存活率明顯減少，形成的集落數(shù)也明顯減少，并且增殖標(biāo)志物Ki67以及PCNA的表達(dá)水平也明顯降低，暗示其可能在調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖方面起到至關(guān)重要的作用，可以作為結(jié)腸腺癌治療有效的分子靶點(diǎn)，但精細(xì)的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

Kinesin可參與中心體復(fù)制的調(diào)控，KIFC1的過表達(dá)會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞多級紡錘體的形成[6]。本研究發(fā)現(xiàn)敲低KIFC1在體外水平能夠明顯影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖水平，其表達(dá)水平也與結(jié)腸腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)。而除了增殖外，KIFC1也通過別的方式調(diào)控腫瘤生長：KIFC1可作為微管與高爾基體的橋梁，從而維持高爾基體的定位與形態(tài)[7]；同時(shí)，高爾基體的囊泡運(yùn)輸也受到KIFC1的調(diào)控。

這些基于Kinesin家族蛋白對腫瘤影響的研究，結(jié)合本研究中已證實(shí)KIFC1參與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖調(diào)控的結(jié)論，以及臨床樣本中驗(yàn)證的高表達(dá)KIFC1與進(jìn)展的臨床分期以及不良預(yù)后相關(guān)，證實(shí)了Kinesin這一馬達(dá)蛋白家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，提示這類蛋白可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，從而發(fā)揮重要的臨床價(jià)值。