王會杰，王建華，張寶楠，王 娜，徐 丹

由于壓力或壓力與剪切作用的結(jié)合而對皮膚或底層組織造成的局部損傷叫做壓瘡[1]，通常涉及到對軟組織的損傷，包括上皮、真皮及皮下組織，例如脂肪和肌肉[2]。損傷的細(xì)胞和組織在恢復(fù)過程中通常存在惡性循環(huán)，即由壓力觸發(fā)的直接變形損傷，繼而引起繼發(fā)性炎癥-水腫損傷，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致缺血性損傷[3]。炎性細(xì)胞因子的富集在壓瘡的病因?qū)W中起主要作用，受壓區(qū)域的組織損傷及相關(guān)基因的表達(dá)增加了白細(xì)胞介素1α(IL-1α)、IL-1β、IL1受體拮抗劑(IL1RA)[4-5]及腫瘤壞死因子(TNF-α)[6]等的濃度，促進(jìn)組織損傷和細(xì)胞壞死[7]。

在創(chuàng)面恢復(fù)過程中，多種影響因子干預(yù)著肌肉的生長發(fā)育。生肌素（Myogenin）蛋白屬于Myo D家族，在肌細(xì)胞分化為成熟肌細(xì)胞的過程中起著重要的調(diào)控作用，并且作用無法代替[8]。肌纖維的增生受肌球蛋白重鏈（MYHC）蛋白的影響，并且MYHC蛋白可以水解ATP為ADP釋放能量，為肌肉收縮提供動力[9]。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31蛋白是免疫球蛋白超家族成員，它可以促進(jìn)血管的生成，擴(kuò)大血管內(nèi)皮的表面積，使新生血管保持活躍[10]。玉紅膏在各類疾病的臨床應(yīng)用中非常廣泛[11]，本研究通過建立動物模型，探討玉紅膏在治療壓瘡過程中對細(xì)胞炎性因子等表達(dá)水平的影響，并分析其作用機(jī)制，為臨床治療慢性創(chuàng)面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（180～200）g，購自北京斯貝福公司；玉紅膏購自天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院；磺胺嘧啶銀軟膏購自廣東恒健制藥有限公司；Masson染色試劑盒（批號BA4079）購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，伊紅染液（批號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司，蘇木素染液（批號BA4041）購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，CD31抗體（批號AF6191）購自Affinity公司，Myogenin抗體（批號Ab124800）、MYHC抗體（批號Ab207926）均購自上海Abcam公司，壓瘡方法參照以往研究的鐵磁加壓造模法[12-13]。

1.2 動物模型制備及分組 將大鼠隨機(jī)分為模型組、玉紅膏治療組、陽性對照組、空白組，每組10只。模型的制作：于大鼠后腿部做一深至筋膜長度約3 cm的切口，鈍性分離組織，植入圓形鐵片（直徑15.0 mm，厚0.3 mm，重0.6 g，高壓滅菌消毒），逐層縫合切口。每天肌注青霉素以預(yù)防全身感染（0.2 mL/只，連續(xù)3 d）。術(shù)后第4天在鐵片相對應(yīng)的皮膚上放置圓形磁鐵以產(chǎn)生壓力（直徑15.0 mm，厚5.0 mm，重2.6 g，磁通量1500高斯，4 h/d，持續(xù)7 d）造成局部組織缺血。第8天為觀察期，參考美國壓瘡學(xué)會2期壓瘡標(biāo)準(zhǔn)，肉眼觀察到受壓部皮膚紅腫，按壓局部小鼠有明顯的疼痛感；病理學(xué)觀察到部分皮層缺損伴真皮層外露，多灶狀潰瘍深達(dá)真皮，真皮層有中等量淋巴細(xì)胞浸潤，較多的炎性細(xì)胞浸潤，肌纖維水腫，間質(zhì)增寬伴隨部分?jǐn)嗔?，提示造模成功?/p>

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 采用低流量生理鹽水沖洗大鼠創(chuàng)面，玉紅膏治療組創(chuàng)面均勻涂抹玉紅膏，陽性對照組創(chuàng)面均勻涂抹磺胺嘧啶銀軟膏，模型組與空白組給予等體積蒸餾水，不予敷料包扎，換藥1次/d，連續(xù)給藥14 d后處死，腹主動脈取血3 mL，3000 r/min分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取大鼠壓瘡部位皮膚（1 cm2），空白組取相同部位正常皮膚，在預(yù)冷生理鹽水中漂洗以去除皮下脂肪及結(jié)締組織。用不同濃度乙醇逐級脫水，浸蠟包埋，切片。1）HE染色觀察組織形態(tài)：脫蠟至水，HE常規(guī)染色，封片鏡檢，鏡下取3個視野觀察。2）Masson染色觀察膠原纖維：脫蠟至水，Bouin固定，Masson常規(guī)染色脫色，封片鏡檢，鏡下取3個視野觀察。

1.3.2 ELISA檢測 血液樣本離心后獲血清，采用ELISA試劑盒檢測血清中IL-1α、TNF-α含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 Western blotting檢測 取大鼠瘡瘍部位皮膚及周圍少量組織進(jìn)行裂解，4 ℃下12 000 r/min離心，BCA定量測定蛋白濃度，變性后進(jìn)行電泳。加入40 μg總蛋白，恒壓80 V電泳至溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓120 V至溴酚藍(lán)到凝膠底部，200 mA開始轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件：CD31組200 mA，120 min后改為300 mA，15 min；Myogenin組200 mA，70 min；GAPDH組 200 mA，90 min；MYHC組 200 mA，120 min后改為300 mA，60 min。5% TBST室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液CD31（1:1 000）/Myogenin(1:200)/GAPDH(1:1 000)/MYHC(1:2 000)，4 ℃孵育過夜。TBST充分洗滌，加1:50 000的HRP標(biāo)記二抗，37 ℃搖床孵育2 h。電化學(xué)：ECL發(fā)光，X線膠片記錄影像，圖像分析儀定量分析條帶。采用Quantity one 4.6.8軟件對Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果灰度值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，多組比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 玉紅膏對大鼠模型局部創(chuàng)面皮膚病理結(jié)構(gòu)影響 空白組的組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，可見毛囊、皮脂腺及大量的膠原纖維，膠原纖維未見明顯的斷裂、萎縮及腫脹，組織內(nèi)未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。模型組的組織整體結(jié)構(gòu)異常，膠原纖維內(nèi)可見大量新生的毛細(xì)血管及少量炎性細(xì)胞浸潤。玉紅膏組的組織整體結(jié)構(gòu)輕度異常，可見毛囊，少量膠原纖維萎縮斷裂，肌間隙增大，間質(zhì)血管充血，組織內(nèi)未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。陽性對照組的組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，可見毛囊、真皮及大量的膠原纖維，膠原纖維未見明顯的斷裂、萎縮及腫脹，組織內(nèi)未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。見圖1、圖2。

圖1 大鼠創(chuàng)面處皮膚組織HE染色（200倍）

圖2 大鼠創(chuàng)面處皮膚組織Masson染色（200倍）

2.2 玉紅膏對2期壓瘡大鼠模型血清中TNF-α、IL-1α水平的影響 玉紅膏組大鼠血清中TNF-α、IL-1α水平低于模型組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1α、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

2.3 玉紅膏對2期壓瘡大鼠模型創(chuàng)面組織中Myogenin、CD31、MYHC蛋白表達(dá)的影響 相對于模型組，玉紅膏組Myogenin蛋白明顯增加（P<0.001）；與陽性對照組比較有所增加。玉紅膏組CD31蛋白與模型組比較呈升高趨勢（P<0.05）；但不及陽性對照組。玉紅膏組MYHC蛋白表達(dá)相對于模型組明顯增加（P<0.001）；與陽性對照組比較，有小幅增加。如圖3、表2。

圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織Myegenin、CD31、MYHC蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織Myogenin、CD31、MYHC蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

壓瘡的成因復(fù)雜，關(guān)于壓瘡預(yù)防、治療及機(jī)制研究都經(jīng)歷了漫長的變遷。目前公認(rèn)的主要成因?yàn)榫植康膲毫?dǎo)致了受壓部位缺血缺氧，從而進(jìn)一步導(dǎo)致組織壞死，形成潰瘍。壓瘡每年影響著數(shù)百萬人，導(dǎo)致了人類生活質(zhì)量顯著下降、個人和醫(yī)療保健系統(tǒng)成本高昂以及高發(fā)病率和高死亡率[14]。感染壓瘡發(fā)生時，若不能給予及時的護(hù)理，會導(dǎo)致并發(fā)癥的產(chǎn)生，嚴(yán)重甚至危及生命[15]。玉紅膏在外科各類創(chuàng)傷的恢復(fù)中有著長足的應(yīng)用，可用于治療慢性下肢潰瘍、燒燙傷、骨科疾病等。

本研究中，2期壓瘡大鼠模型創(chuàng)面紅腫、潰瘍，可見壞死細(xì)胞，病理觀察組織結(jié)構(gòu)不清，大量膠原沉積，與正常皮膚相比具有顯著性差異；玉紅膏用藥組局部皮膚紅腫水泡、潰瘍與模型組相比具有較大差異，病理觀察發(fā)現(xiàn)肌纖維大量增生，炎性細(xì)胞浸潤改善，肌纖維排列緊密，說明玉紅膏在創(chuàng)面的組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)過程中有一定的促進(jìn)作用。

雖然IL-1α在不同類型細(xì)胞中均有表達(dá)，但生理和病理?xiàng)l件下，內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞是IL-1α的主要來源，信號通路主要靠與IL-1RI受體結(jié)合后被觸發(fā)，并且受多種酶的調(diào)控分泌，如鈣蛋白酶、顆粒酶B、凝血酶，最終觸發(fā)和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組IL-1α水平顯著升高(P<0.05)，說明壓瘡造模成功，該方法適用于2期壓瘡模型的構(gòu)建。與模型組比較，玉紅膏組的大鼠血清中IL-1α水平明顯降低，說明玉紅膏可以抑制大鼠模型IL-1α的產(chǎn)生；與陽性對照組比較，玉紅膏組的大鼠血清中IL-1α水平升高，證明玉紅膏可以抑制模型大鼠血清中IL-1α的水平，并優(yōu)于陽性對照藥物。

TNF-α是腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)的20個成員之一，主要由活性巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等分泌，可被LPS、微生物抗原、免疫復(fù)合物、超抗原、IL-1等刺激活化[17]。通常感染、炎癥、燒傷會觸發(fā)TNF-α的產(chǎn)生機(jī)制，造成組織細(xì)胞的持續(xù)炎癥與促凝血反應(yīng)[18]。本實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，模型組TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，說明壓瘡造模成功，該方法適用于2期壓瘡模型的構(gòu)建。與模型組比較，玉紅膏組模型大鼠血清中TNF-α水平顯著降低，說明玉紅膏可以降低2期壓瘡大鼠模型TNF-α的水平；而與陽性對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示玉紅膏能降低大鼠模型血清中的TNF-α水平，從而促進(jìn)壓瘡創(chuàng)面的愈合。

Myogenin蛋白對于肌細(xì)胞的分化具有重要意義，在中胚層細(xì)胞定向成為成肌細(xì)胞過程中表達(dá)并定向調(diào)控，進(jìn)而促使成肌細(xì)胞分化為肌管，最終促使肌細(xì)胞增殖分裂[8]。肌球蛋白重鏈（MYHC蛋白）是衡量肌纖維生長增殖的重要參數(shù)，而肌纖維特性則決定了組織生長的狀態(tài)[19]。CD31蛋白通常在血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、嗜中性粒細(xì)胞中表達(dá)，通過免疫、血管系統(tǒng)黏附、信號傳導(dǎo)等生物功能的組合發(fā)揮作用。在皮膚炎癥、心肌缺血再灌注損傷模型中，阻抗中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的富集，降低炎癥微循環(huán)損傷[20]。本實(shí)驗(yàn)中，玉紅膏用藥組中大鼠Myogenin蛋白、MYHC蛋白高度表達(dá)，均高于模型組，說明本實(shí)驗(yàn)中2期壓瘡大鼠模型造模成功。Myogenin蛋白、MYHC蛋白表達(dá)均高于陽性對照組，提示玉紅膏有助于創(chuàng)面肌細(xì)胞的恢復(fù)，優(yōu)于陽性對照藥物。與模型組相比，玉紅膏用藥組CD31蛋白水平大幅度增加，說明玉紅膏有助于創(chuàng)面微血管的產(chǎn)生，通過重建血液循環(huán)促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

綜上所述，玉紅膏可以通過抑制2期壓瘡大鼠模型炎性介質(zhì)的大量釋放，進(jìn)而控制、減緩炎癥反應(yīng)。并且通過促進(jìn)肌細(xì)胞增殖、微血管的產(chǎn)生重建血液循環(huán)，恢復(fù)創(chuàng)面皮膚，有一定的臨床應(yīng)用價值。