郭佩佩，劉海峰,2，潘 明,2，謝秋波,2

（1.廣州市健坤網(wǎng)絡(luò)科技發(fā)展有限公司，廣東 廣州 510630；2.廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備研究所，廣東 廣州 510630）

0 引言

牛奶具有高蛋白質(zhì)和高脂肪含量，是日常生活中必不可少的營養(yǎng)品之一。自“三聚氰胺奶粉”“老酸奶工業(yè)明膠”“塑化劑超標”等事件發(fā)生后，奶粉及牛奶等奶制品的質(zhì)量安全問題越來越受到公眾的質(zhì)疑與關(guān)注，上述事件多屬于奶制品加工過程中添加違禁物以提高其“質(zhì)量”。除此之外，奶制品的生產(chǎn)源頭面臨更嚴峻的考驗和挑戰(zhàn)，即原料奶的質(zhì)量安全問題，主要表現(xiàn)為牛奶中抗生素殘留，來源于養(yǎng)殖過程中用于預(yù)防和治療動物疾病，或是在飼料添加劑中的抗生素超劑量濫用和不合理配比使用等，導(dǎo)致藥物在奶牛體內(nèi)的正常代謝受到嚴重影響，使得原料奶中形成了對人體有害的殘留物質(zhì)[1-3]。

抗生素殘留已經(jīng)拉響了我國奶源安全的警報。2009 年鄧霞等人隨機對某市的48 份品牌袋裝奶，按照國標法進行測定，抗生素殘留呈陽性結(jié)果的牛奶樣品數(shù)為17 份，陽性率超過30 %。2012 年和2013年畜禽產(chǎn)品檢測中分別有4 批和7 批產(chǎn)品存在環(huán)丙沙星、恩諾沙星以及氯霉素超標的問題；2015 年山西省獸藥飼料監(jiān)察所在農(nóng)業(yè)部畜禽及畜禽產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計劃檢測抽檢的83 批次牛奶樣品中有1 批是β-內(nèi)酰胺類抗生素超標[1]。

1 氟喹諾酮類抗生素的危害

氟喹諾酮（fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）類抗生素是含有6-氟-7-哌嗪-4-諾酮環(huán)結(jié)構(gòu)的第三代喹諾酮類衍生物[3-4]。由于該類抗生素具有抗菌活性強、抗菌譜廣、組織滲透性好等優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖中治療腸胃疾病等細菌感染性疾病[5]。FQs 代表藥物主要包括恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、達氟沙星（Danofloxacin，DAN）、氟羅沙星（Fleroxacin，F(xiàn)LE）、沙拉沙星（Saraflaxacin，SFX）、依諾沙星（Enoxacin，EX）等。由于致病菌產(chǎn)生耐藥性和某些FQs 的潛在致癌性質(zhì)，其殘留問題已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。

此類抗生素在奶牛養(yǎng)殖過程中的超量使用或者濫用會導(dǎo)致產(chǎn)出牛奶中存在殘留。有研究表明，F(xiàn)Qs可通過食物鏈進入到人體，會對人體的多系統(tǒng)造成損傷（如肌痛、骨關(guān)節(jié)病損等），并導(dǎo)致耐藥性致病菌的產(chǎn)生[6]。若該類牛奶經(jīng)常被食用，會增加食用者體內(nèi)食源性病原菌的耐藥性，導(dǎo)致部分人產(chǎn)生過敏反應(yīng)和藥物不良反應(yīng)。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雖在相關(guān)標準中規(guī)定了牛/羊奶中恩諾沙星的最大殘留限量為100 μg/Kg，達氟沙星的最大殘留限量為30 μg/Kg。但由于養(yǎng)殖奶牛過程中超量、或盲目或不按規(guī)定濫用FQs 現(xiàn)象時有發(fā)生，牛奶中FQs 超標問題依然嚴重。

2 檢測技術(shù)

目前關(guān)于牛奶中FQs 抗生素殘留的檢測方法可分為3 大類：儀器分析法、快速分析法以及微生物檢測法。

2.1 儀器分析法

2.1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）具有分離效能高、應(yīng)用范圍廣、用量少、準確度高、樣品易回收等優(yōu)點，在氟喹諾酮類抗生素殘留分析中得到了很好的應(yīng)用。HPLC 法常結(jié)合不同的檢測器進行測定，如熒光檢測器（FLD）、紫外可見光檢測器（UVD）等，但存在樣品前處理復(fù)雜、色譜分離條件要求髙、檢測時間長、能同時檢測的藥物種類少等局限。BOZKURT等[7]利用基于殼聚糖吸附劑的離子液體來分離和富集環(huán)丙沙星、馬波沙星等5 種氟喹諾酮類抗生素，并采用HPLC-FLD 法實現(xiàn)了上述5 種抗生素的檢測。該法成功實現(xiàn)了牛奶、魚等動物源性食品中氟喹諾酮類抗生素的檢測，回收率為70%～100%。方永衛(wèi)等[8-9]利用 HPLC-UVD 法建立測定牛奶中麻保沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星含量的方法，并在最佳流動相和檢測條件下，得到最佳色譜分離圖，3 種目標物的檢測限均為0.5 μg/mL，3 種目標物在牛奶樣品的添加回收率為97.8%～105.4%，證明該方法可靠性良好，可以用于檢測牛奶等動物性食品中的氟喹諾酮類抗生素殘留。

2.1.2 液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜-質(zhì)譜法因結(jié)合了色譜與質(zhì)譜的優(yōu)點，在某些分子量大、熱穩(wěn)定性差的化合物的分離和鑒定中具有獨特的優(yōu)勢，因此液相色譜-質(zhì)譜法在當前動物源性食品中抗生素殘留檢測中使用較多。LINA 等[10-11]用 LC-MS 對生牛乳和脫脂牛乳中的15種FQs 同時定量和確證，檢測限分別為 0.01～1.93、0.03～4.23 ng/mL。饒勇等[12]采用LC-MS 法實現(xiàn)了牛奶中環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、培氟沙星、麻保沙星等10 種喹諾酮類抗生素殘留的同時檢測。MARILENA 等[13]采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，結(jié)合固液萃取的前處理技術(shù)，以0.1%加酸-0.1%甲酸甲醇為流動相，開發(fā)了一種可用于奶粉、雞蛋等20 多個不同類別食物中115 種抗生素殘留的檢測方法。

目前高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是用于檢測氟喹諾酮類抗生素較先進的方法，尤其串聯(lián)質(zhì)譜可以消除基質(zhì)干擾，可大幅度減少液相色譜的雜峰干擾，解決目標物準確定性和精確定量問題，使檢測結(jié)果更精準，檢測時間更短。2020 年11 月18 日，焦作市奶業(yè)協(xié)會制定并發(fā)布了團體標準 T/JZNX 006—2020 牛奶中四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素類、酰胺醇類、喹諾酮類、磺胺類獸藥多殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

2.1.3 熒光分光光度法

熒光分光光度法具有操作簡便、試劑用量少、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，在痕量物質(zhì)檢測方面具有明顯優(yōu)勢。常用于氟喹諾酮類抗生素檢測的有直接熒光分析法、膠束增敏熒光分析法等[14]。席會平等[10，15]通過研究不同表面活性劑對抗生素的顯著熒光增敏作用，建立了基于十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）增敏熒光分光光度法測定牛奶中的環(huán)丙沙星殘留的方法。該方法得出的檢測限為15.5 μg/L，在牛奶中的平均回收率為92.6%。

2.2 快速分析法

2.2.1 熒光免疫分析法(FIA)

熒光免疫法主要有熒光免疫分析法、熒光偏振免疫分析法、時間分辨熒光免疫分析法[16]。XIA 等[17]通過利用鋁敏化分光光度法與鹽析輔助液—液超聲萃取相結(jié)合，建立了一種測定牛奶中4 種氟喹諾酮類抗生素的簡單、綠色的檢測方法。熒光免疫分析方法具有操作簡便、特異性強等特點，但存在易產(chǎn)生光漂白現(xiàn)象等不足。CHEN 等[18]利用熒光示蹤劑建立了熒光偏振免疫分析法，進而高靈敏度實現(xiàn)了奶制品中克林沙星殘留的檢測，其回收率范圍在86.8%～104.5%之間。米鐵軍等[16，19]采用單試劑熒光偏振免疫分析法實現(xiàn)了牛奶中達氟沙星、環(huán)丙沙星等5 種氟喹諾酮類抗生素殘留的檢測，且檢測限均低于15 μg/L。熒光偏振免疫分析法操作簡單、靈敏度較高，可用于氟喹諾酮類抗生素殘留快速篩查，但存在設(shè)備價格昂貴等局限性。而時間分辨熒光免疫分析法依據(jù)鑭系元素螯合物能發(fā)光且衰變時間長等特點，通過時間分辨，可極大降低本底熒光，實現(xiàn)高信噪比，且克服了放射免疫分析法有效期短的缺陷，檢測成本較低。LEIVO 等[16，20]建立了一種全脂牛奶中環(huán)丙沙星的時間分辨熒光免疫測定法，在0.2～68.0 μg/L 范圍內(nèi)特異性強。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測速度快、分析成本低、靈敏度較高，適用于大批量樣品的快速篩查與現(xiàn)場分析。目前，ELISA 檢測方法已經(jīng)相當成熟。BUCKNALL 等[21-22]通過制備幾種喹諾酮和氟喹諾酮半抗原得到多克隆抗體?；诖丝贵w的ELISA檢測方法可對牛奶中存在的5 種喹諾酮類抗生素進行殘留分析，批間RSD 為11.2%。李燕君等[23]建立了一種同時快速檢測牛奶中的6 種氟喹諾酮類抗生素殘留（氧氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、諾氟沙星、培氟沙星和恩諾沙星）的ELISA 法。ELISA 法測得的最低檢測限為1.48 μg/L，50%抑制濃度范圍在0.254～0.361 μg/ L；進行加標回收試驗時，6 種氟喹諾酮類抗生素殘留添加濃度為5 μg/L 時，回收率為87.2%～115.92%。該方法回收率、最低檢測限與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法接近，適合大批量樣本的快速檢測。

2.2.3 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法因具有檢測速度快、操作簡便、檢測成本低、易于實現(xiàn)自動化和現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，在食品安全檢測、環(huán)境分析等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。而氟喹諾酮類抗生素有電活性基團，可以用電化學(xué)分析法進行測定。席會平等[24]以左氧氟沙星與四苯硼酸根形成的締合物為電活性物質(zhì)，研制了一種涂層玻璃電極。該電極響應(yīng)范圍為 2.0×10-5～ 5.0×10-3mol/L，對 Mg2+、Pb2+、Cd2+、NO3-、Ac-、I-、IO4-、C2O42-、Br-等離子基本無響應(yīng)。邢濤等[25]采用羧基化多壁碳納米管修飾玻碳電極，并通過循環(huán)伏安法實現(xiàn)了依諾沙星的檢測，試驗結(jié)果表明：依諾沙星峰電流與其濃度在0.02～0.20 μg/mL 范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，檢出限為0.01 μg/mL。SI 等[26]通過電沉積制備了石墨烯與氧化鋅的納米復(fù)合物修飾玻碳電極，用于檢測氧氟沙星，發(fā)現(xiàn)在1～100 μmol/L 的范圍內(nèi)，峰電流強度與氧氟沙星呈正比關(guān)系，其檢出限達到0.33 μmol/L。

2.2.4 表面增強拉曼散射方法（SERS）

表面增強拉曼散射方法作為一種預(yù)處理相對簡單、特異性強、水環(huán)境干擾弱、檢測方便快捷的方法，被大量應(yīng)用于食品、環(huán)境等領(lǐng)域分子層面檢測。孫佳[27]使用銀溶膠作為 SERS 活性基底，對牛奶中的環(huán)丙沙星和恩諾沙星進行檢測，最低檢測限分別為 50 μg/mL 以及 25 μg/mL，回收率范圍分別為92.6%～108.3%，93.9%～108.8%，RSD 分別小于2.26%和 7.91%，說明SERS 技術(shù)對于牛奶中抗生素殘留具有良好的特異性，能夠作為一種快速便捷的檢測技術(shù)去實現(xiàn)牛奶中抗生素的檢測。

將表面增強拉曼光譜與免疫分析技術(shù)進行結(jié)合，建立的 SERS 免疫檢測技術(shù)，不僅具有SERS 技術(shù)高靈敏性、高專一性、非破壞性識辨能力，還具有免疫分析的高特異性、高選擇性和易于操作等特性。史巧巧等[28]通過在制備的金納米粒子表面上分別標記拉曼信號分子和新霉素（諾氟沙星）單克隆抗體來制備具有強 SERS 信號的拉曼免疫探針，并組裝了帶有兩條 T 線的免疫層析試紙，實現(xiàn)了新霉素和諾氟沙星的同時檢測，并在0.000 1～1.0 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性良好，檢測限分別達到了0.37 pg/mL 和0.55 pg/mL。對牛奶進行加標回收，其回收率在86%～121%之間，RSD 在3%～6%之間。該方法靈敏度高，檢測限較低，可以用于牛奶中氟喹諾酮類抗生素殘留檢測。

2.2.5 適配體傳感器法

核酸適配體是指具有特定的生物學(xué)功能核酸分子。功能性核酸能與多種目標物實現(xiàn)特異性結(jié)合，當與靶向目標物相結(jié)合后發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，實現(xiàn)信號的傳導(dǎo)?？衫眠m配體的特異性，檢測多種靶向目標物，如抗生素殘留、重金屬等[30]。田潤等[31]研制了一種基于DNA 信號放大技術(shù)的適配體生物傳感器，用于檢測牛奶中恩諾沙星殘留。首先選擇能識別恩諾沙星的兩段核酸適配體，通過夾心法，實現(xiàn)兩段適配體對目標物的特異性捕獲，通過末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）使組裝在納米金表面的核酸適配體進行T 堿基擴增后，并與15 nm 的Au@poly A 進行雜交得到TAuC 納米金復(fù)合物。通過試紙條組裝，研制得到基于TAuC 信號放大后適配體傳感器，實現(xiàn)了恩諾沙星殘留的高靈敏度檢測，在0.1～104μg/L 的5 個數(shù)量級間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為0.1 μg/L，比常規(guī)納米金試紙條低1 000 倍，并在牛奶、魚糜等中進行加標試驗，取得了不錯的效果，對現(xiàn)場快速檢測具有重大意義。

2.3 微生物檢測法

微生物檢測法是應(yīng)用最早而廣泛的方法，常用檢測方法主要有微生物抑制法、微生物受體法和酶比色法3 種。其優(yōu)點是操作簡單、費用低，比較適用于樣品的大量、快速篩選檢測以及定性檢測，且與其他方法相比較，靈敏度與特異性偏低，有待進一步提高。APPICCIAFUOCO 等[32]利用微生物光學(xué)方法對牛奶中環(huán)丙沙星和恩諾沙星進行了檢測，主要是基于大腸桿菌的生長抑制試驗來實現(xiàn)氟喹諾酮類抗生素的檢測。該檢測方法中環(huán)丙沙星和恩諾沙星檢出限偏低，為100 μg/L，只能用于牛奶中高濃度殘留的檢測。

3 結(jié)論與展望

牛奶中抗生素殘留超標不僅直接影響到人民群眾“舌尖上的安全”，還帶來了細菌耐藥性、生態(tài)環(huán)境污染等問題。隨著科技發(fā)展，分析技術(shù)得到快速發(fā)展，高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法等被廣泛應(yīng)用于FQs 殘留的檢測中，但色譜法/質(zhì)譜法存在設(shè)備價格昂貴、操作復(fù)雜、難以移動、樣品前處理繁瑣等問題，普及較難，不適合現(xiàn)場檢測；酶聯(lián)免疫吸附測定法靈敏度較高、特異性較強，但會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，需提高檢測的準確度。目前，抗生素殘留檢測分析技術(shù)向高靈敏度、現(xiàn)場快速分析、高選擇性方向發(fā)展，其分析儀器向微型化、自動化、集成化和便攜化方向發(fā)展。電化學(xué)分析法和生物傳感器法存在測定簡單、快速、成本低、易于小型化、方便攜帶等特點，在牛奶樣品中氟喹諾酮類抗生素快速篩查與監(jiān)測方面應(yīng)用前景廣闊?？赏ㄟ^探索與研制合成性能優(yōu)異的納米材料，篩選合適的表面修飾材料固化方法，用以提高電化學(xué)分析法和生物傳感器法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。還可加強與其他檢測方法的聯(lián)用，如表面增強拉曼散射方法、表面等離子體共振方法等，用以拓寬氟喹諾酮類抗生素檢測范圍，為監(jiān)管部門加強對牛奶中氟喹諾酮類抗生素殘留檢測與監(jiān)管提供有效的檢測手段的同時，保障人民群眾食品質(zhì)量安全，促進我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。