袁嬌，強(qiáng)金萍，馬海佳

（銀川市婦幼保健院新生兒科，寧夏 銀川 750001）

0 引言

新生兒呼吸窘迫綜合征(r esp ir ator yd istr ess sy nd r om e,NRDS)是一種以呼吸衰竭和氣體交換改變?yōu)樘卣鞯亩嘁蛩丶膊?，主要由肺發(fā)育不成熟導(dǎo)致的肺表面活性物質(zhì)（p ulmonary surfactant，PS）產(chǎn)生不足引起，是早產(chǎn)兒死亡的主要原因。PS是一種復(fù)雜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的混合物，它的產(chǎn)生隨著妊娠期的增加而增加，所以胎齡越小RDS的發(fā)病率越高[1]。近些年來，越來越多的研究揭示PS的成分，特別是表面活性物質(zhì)蛋白的遺傳學(xué)變異與NRDS的發(fā)生密切相關(guān)[2-5]，本文就與NRDS發(fā)生有關(guān)的基因變異進(jìn)行論述。

1 表面活性蛋白 A (surfactantproteinA,SP-A)

SP-A與病原體結(jié)合，通過激活或失活肺泡巨噬細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)微生物的吞噬作用[6]。SP-A通過結(jié)合脂質(zhì)和微生物表面的碳水化合物部分，維持表面活性物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)和防御呼吸道病原體的入侵[7]。SP-A是最豐富的表面活性物質(zhì)蛋白，它調(diào)節(jié)磷脂的插入以及肺泡Ⅱ型細(xì)胞[8]對(duì)磷脂的攝取和分泌。既往研究發(fā)現(xiàn)，SP-A缺乏會(huì)影響正常的肺功能和表面活性物質(zhì)代謝，并導(dǎo)致免疫病理缺陷[9,10]，妊娠后期羊水中SP-A表達(dá)的升高是決定胎兒肺成熟度的生物標(biāo)志物，而SP-A表達(dá)的缺失可能預(yù)測(cè)嬰兒的RDS[11]。Perez-Gil等人發(fā)現(xiàn)，肺表面活性物質(zhì)蛋白SP-A及SP-B是RDS發(fā)展的主要因素[12]，血清SP-A水平的降低與RDS的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，并可能作為RDS監(jiān)測(cè)的新的生物標(biāo)志物。

人類SP-A由位于10號(hào)染色體q21-q23的SFTPA基因編碼，是c型凝集素亞家族的成員，由兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相反但功能高度同源的基因SFTPA 1和SFTPA 2(SP-A 1和SP-A 2)組成，它們編碼相似但不同的蛋白質(zhì)。SP-A 1和SP-A 2基因處于連鎖不平衡狀態(tài)，這兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)由四個(gè)編碼外顯子（Ⅰ-Ⅳ）組成，它們的編碼核苷酸差異導(dǎo)致蛋白膠原樣結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸發(fā)生變化，這些變化可以區(qū)分SP-A 1和SP-A 2基因產(chǎn)物以及它們相應(yīng)的變體。在SP-A 1和SPA 2編碼區(qū)和非編碼區(qū)（103,106,107）中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotid e p oly m or p hism s,SNPs)。SP-A 1和SP-A 2蛋白分子都由248個(gè)氨基酸組成：在SP-A 1的Met66、Asp 73、Ile81和Cy s85，SP-A 2（44,102,103,108）的Thr66、Asn73、Val81和Arg85的殘基上存在差異。變異6A、6A 2、6A 3、6A 4、6A 5是SP-A 1外顯子內(nèi)5個(gè)雙等位SN Ps的組合，對(duì)應(yīng)氨基酸19、50、62、133和219，分別由rs1059047、rs1136450、rs1136451、rs1059057和rs4253527的組合決定。SP-A 2變體1A 0、1A 1、1A 2、1A 3和1A 5分別涉及氨基酸9、91、140和223的4個(gè)外顯子

SNPs(rs1059946、rs17886395、rs1965707、rs1965708)。在大多數(shù)研究中，一種特定的SP-A 1/SP-A 2單倍型6A 2/1A 0，與RDS風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[13-15]。研究證實(shí)SFTPA的多態(tài)性參與了早產(chǎn)兒RDS的發(fā)生，SFTPA的AA和CC基因型與RDS風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)[5]。Ramet發(fā)現(xiàn)RDS患者中SP-A 1的等位基因6A 2在RDS組過表達(dá)，6A 3為低表達(dá)；RDS患者中SP-A 2的等位基因1A 0為過表達(dá)，并且胎齡小于32周前更為明顯，表明6A 2及1A 0是RDS易感性基因，RDS保護(hù)基因?yàn)?A 3[16]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)RDS組的SP-A 2等位基因1A 0無過表達(dá)[17]，SP-A 1的等位基因6A 2為蒙古族早產(chǎn)兒的易感基因，而6A為保護(hù)基因[18]，造成結(jié)果的差異可能與種族因素不同有關(guān)，今后可針對(duì)不同種族進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2 表面活性蛋白B(surfactant protein B,SP-B)

SP-B是一種低分子量的極性疏水蛋白，可以降低表面活性劑脂類的表面張力，特別是它可以吸附到氣液界面并在氣液界面擴(kuò)散。SP-B是商業(yè)上用于治療RDS的替代表面活性物質(zhì)的關(guān)鍵組成部分。SP-B由人類2號(hào)染色體的SFTPB基因編碼，SFTPB兩個(gè)等位基因的完全功能缺失序列變異可導(dǎo)致嚴(yán)重的、彌漫性肺部疾病，通常在出生時(shí)出現(xiàn)。SP-B缺乏癥是進(jìn)行性的，通常在出生后的前三個(gè)月內(nèi)致命，由于疾病的兩個(gè)等位基因都需要序列變異，該疾病以常染色體隱性方式遺傳[19]。于1993年首次在足月嬰兒中發(fā)現(xiàn)[20]。臨床統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，SP-B缺乏癥的發(fā)病率為每百萬分之一，而121in s2突變的頻率約為1/1000[21]。SFTPB基因由12個(gè)外顯子組成，迄今為止，在SFTPB基因中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40多個(gè)不同的突變，通常位于前9個(gè)外顯子，主要分布于第2、4、7外顯子，包括錯(cuò)義、無義密碼子、剪接及移碼突變，其中最常見在SFTPB第4外顯子12密碼子插入2bp，移碼后出現(xiàn)外顯子6提前產(chǎn)生終止密碼子，導(dǎo)致缺乏成熟的SP-B蛋白，這種突變占等位基因突變的三分之二。目前，較多學(xué)者對(duì)SFTPB的基因突變進(jìn)行研究，張亞昱利用PCR技術(shù)對(duì)患有RDS的內(nèi)蒙古地區(qū)的早產(chǎn)兒進(jìn)行SFTPB基因第4外顯子測(cè)序，沒有發(fā)現(xiàn)存在基因突變，但RDS組的T131I位點(diǎn)C等位基因分布頻率增高[22]。也有學(xué)者對(duì)武漢漢族新生兒的T131I位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)等位基因C的頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但C等位基因的頻率與美國(guó)人及德國(guó)人存在差異，均證實(shí)基因突變的頻率存在一定差異[23]。Ballard等證實(shí)外顯子7突變可以降低SFTPB的翻譯功能，影響SP-B蛋白的含量[24,25]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)外顯子7突變研究甚少，學(xué)者對(duì)47例患有RDS的內(nèi)蒙古新生兒進(jìn)行第7外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)不存在基因突變[26]。綜上，不同地區(qū)與民族基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可通過加大樣本量進(jìn)行分析，為RDS的基因診斷及干預(yù)提供遺傳學(xué)依據(jù)。

3 表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)

SP-C是一種含有35個(gè)氨基酸的疏水蛋白，與SP-B一起以降低表面活性劑的表面張力。8號(hào)染色體短臂的SFTPC基因包含6個(gè)外顯子，其編碼表達(dá)含有197個(gè)氨基酸的SP-C前體，首先由一個(gè)N端前肽結(jié)構(gòu)域和C端br ichos結(jié)構(gòu)域(p ro-SPC)產(chǎn)生，隨著成熟蛋白被加工，N端結(jié)構(gòu)域從p ro SPC形式分裂為SP-C。成熟的蛋白有一個(gè)縮短的N端結(jié)構(gòu)域、連接體和C端brichos結(jié)構(gòu)域(圖1)。

圖1 頂部面板表示8號(hào)染色體上SFTPC的外顯子

SFTPC基因位點(diǎn)跨越3500bp，其致病性變異一半為新生變異。具有致病性SFTPC變異的個(gè)體最常見的臨床表現(xiàn)為嬰兒、兒童或成人的散發(fā)性或家族性間質(zhì)性肺病以及新生兒的RDS[27]。病程變化多變，一些新生兒表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸衰竭需要肺移植，另一些新生兒表現(xiàn)為長(zhǎng)期機(jī)械通氣治療的慢性疾病，以及其他無癥狀的患者。在新生兒肺部疾病中發(fā)現(xiàn)SFTPC基因突變常見的位點(diǎn)位于73位上的錯(cuò)意突變，為異亮氨酸被蘇氨酸取代(I73T)。Lahti對(duì)芬蘭245例胎齡小于34周的早產(chǎn)患兒進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)外顯子4、5的P.N 138T和P.N 186S位點(diǎn)突變與NRDS密切相關(guān)，突變后表達(dá)的異常SP-C蛋白會(huì)被體內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白酶體識(shí)別并吞噬和降解，導(dǎo)致SP-C的合成明顯減少[28]。另外，國(guó)外學(xué)者對(duì)伊朗地區(qū)人群NRDS的易感性進(jìn)行SFTPC基因rs1124的多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)男性純合AA基因型早產(chǎn)兒具有更高的易感性。Wambach對(duì)歐洲和非洲538例胎齡大于34周的新生兒進(jìn)行SFTPC基因分析，并未出現(xiàn)P.N 138T和P.N 186S位點(diǎn)突變，而啟動(dòng)子中c.1647、c.-1167及c.-2385出現(xiàn)異常表達(dá)，使SFFPC基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生異常，增加NRDS疾病風(fēng)險(xiǎn)[27]。戴儀[29]等對(duì)國(guó)內(nèi)90例早產(chǎn)兒進(jìn)行研究未發(fā)現(xiàn)上述位點(diǎn)突變，但在5'UTR的c.-368A>G、c.-1614C>A及c.-1504G>A檢測(cè)存在位點(diǎn)突變。這些位點(diǎn)是否具有致病性或易感性，有待完善功能學(xué)或加大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 表面活性蛋白D(surfactant protein D,SP-D)

表面活性物質(zhì)蛋白D是一種模式識(shí)別分子，屬于含膠原蛋白的C型凝集素，它的組織分布和功能與SP-A蛋白部分重疊。SP-D的一個(gè)主要作用是聚集和增強(qiáng)微生物和死亡宿主細(xì)胞的吞噬作用。SP-D定位于肺組織和非肺組織，該蛋白與呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、腺體、生殖道、尿路和血管上皮細(xì)胞和腺體有關(guān)。SP-D在肺中的一個(gè)主要功能是作為肺表面活性物質(zhì)脂質(zhì)水平的調(diào)節(jié)器[30]。人類SP-D由SFTPD編碼，該基因位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂22.2-23.1，共包含8個(gè)外顯子，其中7個(gè)是編碼的，外顯子Ⅰ和外顯子Ⅱ的一部分對(duì)應(yīng)5'UTR，第8外顯子的最后一部分對(duì)應(yīng)3'UTR。在德國(guó)的一項(xiàng)研究中[31]，非編碼基因位點(diǎn)rs1923537對(duì)RDS具有保護(hù)作用，而Kelli等人發(fā)現(xiàn)r s1923537多態(tài)性可能與低胎齡早產(chǎn)兒RDS風(fēng)險(xiǎn)顯著增加相關(guān)[32]，但在國(guó)內(nèi)的研究中未發(fā)現(xiàn)這種關(guān)聯(lián)，且Met11Thr T/C和Ala160Thr G/A多態(tài)性與早產(chǎn)兒RDS無關(guān)[5]。另一項(xiàng)研究確定了SP-A 1、SP-A 2和SFTPD的幾種單倍型，它們也與RDS保護(hù)作用相關(guān)，這些類型包括單倍型SP-A 2/SP-D：1A 1-Thr160(rs2243639)、1A 1-Met11(rs721917）-Thr160（rs2243639）和S P-A 1/S P-A 2/S P-D：6 A 4-1 A 2-T r 160（r s22 43639）、6A 3-1A 1-M et11（rs721917）-Thr160（rs2243639)和6A 4-1A 2-Met11（rs721917）-Thr160(rs2243639)[33]。Gow er認(rèn)為SFTPD中的序列變異尚未被報(bào)道為導(dǎo)致人類疾病的原因[34]，目前SFTPD的多態(tài)性與早產(chǎn)兒RDS風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系尚未完全確定，今后可進(jìn)行進(jìn)一步研究。

5 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A3（adenosinetriphosphate-binding cassettetransporters A3，ABCA3)

肺表面活性物質(zhì)儲(chǔ)存在肺泡Ⅱ型細(xì)胞中的層狀體中，對(duì)降低表面張力至關(guān)重要的脂質(zhì)通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCA 3家族的成員A 3導(dǎo)入層狀體中。因此，ABCA 3的缺失導(dǎo)致表面活性物質(zhì)缺乏磷脂酰膽堿和表面活性張力的增加[35-36]。ABCA 3缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳病，由ABCA 3的致病性變異引起。ABCA 3中的雙等位基因變異會(huì)導(dǎo)致新生兒嚴(yán)重RDS[37-38]。具有雙等位基因ABCA 3移碼或無義變異的嬰兒在出生時(shí)可出現(xiàn)NRDS，并在未進(jìn)行肺移植的出生后第一年內(nèi)死亡[39]。

人類ABCA 3基因位于16號(hào)染色體q13.3，含有33個(gè)外顯子，ABCA 3cDNA編碼一個(gè)含有1704個(gè)氨基酸的多肽。成熟的ABCA 3蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊，并在高爾基體中進(jìn)行糖基化[40]。第二種翻譯后修飾涉及到190k D蛋白的n端蛋白水解，將蛋白縮短到150k D（見圖2）。迄今為止已有超過200個(gè)ABCA 3突變被報(bào)道，并且被認(rèn)為該基因純合突變是導(dǎo)致重癥NRDS的重要因素[41-43]。p.E292V，p.R1333G，p.E690K，p.Y1515X，p.W1142X及p.L1553P是報(bào)道較多的突變位點(diǎn)，突變的類型為錯(cuò)義、無義突變，缺失、移位、插入等。錯(cuò)義的ABCA 3基因變異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ABCA 3蛋白運(yùn)輸?shù)闹袛?，?duì)蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響。Mitsiakos等報(bào)道了一例位于ABCA 3基因第23外顯子的錯(cuò)義變異，影響了肺泡表面活性物質(zhì)之間的相互作用，導(dǎo)致致死性NRDS的發(fā)生[44]。Bozkurt發(fā)現(xiàn)位于第24外顯子的錯(cuò)義變異導(dǎo)致了一個(gè)中性亮氨酸殘基取代位于1226位的一個(gè)非極性疏水脯氨酸殘基，可以影響細(xì)胞內(nèi)的相互作用，亦可引發(fā)重癥NRDS[43]。已確定了ABCA 3錯(cuò)義變異的兩種機(jī)制類型包括細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸中斷和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)受損[45,39]。Wambach發(fā)現(xiàn)最常見的致病性變異p.E292V可以損害磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)[46]，在基因組聚合數(shù)據(jù)庫(kù)中p.E292V變異存在于0.4%的個(gè)體中，國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在NRDS患兒中的發(fā)生率為3.8%，且呈現(xiàn)出不同的人群和地域差異[47]。因?yàn)榇蠖鄶?shù)ABCA 3變異都是罕見，這給開發(fā)變異特異性基因編輯或靶向藥物方法帶來了挑戰(zhàn)。

圖2 上面板：代表16號(hào)染色體上ABCA3的外顯子

ABCA 3基因位點(diǎn)多態(tài)性是NRDS的風(fēng)險(xiǎn)因素，但是是國(guó)內(nèi)外存在爭(zhēng)議的地方，研究者[48]對(duì)非洲和歐洲各200余例NRDS患兒進(jìn)行基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)均存在多個(gè)位點(diǎn)的同義突變，而常見的同義突變不會(huì)增加該病的患病率，可能原因與胎齡和種族不同有關(guān)。Kaljalainen[49]發(fā)現(xiàn)第十外顯子的位點(diǎn)rsl3332514(F353F)等位基因T頻率的增加與芬蘭患兒RDS的發(fā)病有關(guān)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)陜西地區(qū)60例NRDS患兒進(jìn)行基因檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因突變[50]。梅花等學(xué)者對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族及漢族NRDS患兒進(jìn)行F353F基因位點(diǎn)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)無論是蒙古族還是漢族NRDS組患兒T等位基因頻率與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外發(fā)現(xiàn)中國(guó)兒童RDS的發(fā)病與p.P585P位點(diǎn)突變有關(guān)聯(lián)[51]。所以，ABCA 3位點(diǎn)突變和多態(tài)性是否與NRDS相關(guān)需要進(jìn)行不同地區(qū)多中心聯(lián)合研究以明確地域、種族及民族等因素對(duì)NRDS疾病的影響，同時(shí)利用基因的功能性機(jī)制揭示該病的發(fā)生機(jī)理。

6 甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcriptionfactor 1 ，TTF-1)

TTF-1是一種細(xì)胞核蛋白，是甲狀腺過氧化物酶和甲狀腺球蛋白基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，研究者發(fā)現(xiàn)TTF-1也是肺發(fā)育中一種具有組織特異性的核轉(zhuǎn)錄因子。TTF-1由NKX2-1基因編碼，該基因位于14號(hào)染色體q13.3，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，其對(duì)肺、甲狀腺和腦的發(fā)育至關(guān)重要。NKX2-1序列變異或缺失可導(dǎo)致腦一肺一甲狀腺綜合征（brain-lung-thyroid sy nd r ome，BLTS）[52]，可表現(xiàn)為RDS、舞蹈癥和甲狀腺功能減低，為常染色體顯性遺傳。目前我國(guó)對(duì)BLTS病例報(bào)道較少，BLTS的肺部表現(xiàn)62.5%～76%為NRDS，19%～75%發(fā)展為慢性持續(xù)性肺間質(zhì)病變[53,54]。正常情況下，NKX2-1表達(dá)于細(xì)支氣管細(xì)胞、末梢支氣管Clara細(xì)胞及肺泡Ⅱ型細(xì)胞。NKX2-1對(duì)SFTPA、SFTPB、SFTPC及SFTPD啟動(dòng)子的活性有著正向的調(diào)節(jié)功能，并調(diào)控著ABCA 3的表達(dá)。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了100多種NKX2-1基因的缺陷，其中陳杰華發(fā)現(xiàn)14q13.1q21.3微缺失和示NKX2-1c.1161C>A（p.Y387X）雜合變異可導(dǎo)致NRDS的發(fā)生[55]，與Iwatani報(bào)道的患者相似[56]。所以，當(dāng)新生兒出現(xiàn)RDS伴有神經(jīng)系統(tǒng)及甲狀腺功能異常時(shí)，應(yīng)考慮NKX2-1基因突變或染色體缺失的可能。

綜上，N RDS的發(fā)生與遺傳因素密切相關(guān)，其中SFTPA、SFTPB、SFTPC、SFTPD、ABCA 3及NKX2-1基因突變扮演了重要的角色，但在不同的地域、種族及民族之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，今后可進(jìn)行不同地區(qū)多中心聯(lián)合研究，為NRDS的診治提供新的理論依據(jù)，有效地從基因水平預(yù)防和診療新生兒肺部疾病，降低早產(chǎn)兒的病死率。