宋麗莉， 吳 瓊， 吉喜燕， 羅瑞莉， 劉文娜， 趙華強(qiáng)， 侯梅芳

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院， 上海 201418)

光是植物進(jìn)行光合作用的能量來源，也是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和形態(tài)建成的重要環(huán)境信號，還是影響植物生長、存活和分布的重要生態(tài)因子[1]。但是，當(dāng)植物吸收的光能超過其光合作用所需能量時，過剩的光能會引起活性氧積累，導(dǎo)致光系統(tǒng)受到損傷，光合水平下降，植物生長發(fā)育受阻[2]。

香果樹(EmmenopteryshenryiOliv.)系茜草科(Rubiaceae)香果樹屬(EmmenopterysOliv.)惟一種，是中國特有的單種屬植物，也是茜草科植物系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、形態(tài)演替及中國植物地理區(qū)系研究的重要材料[3]。此外，香果樹還具有很高的觀賞、藥用和材用價值。然而，野生香果樹種群正在不斷衰退，分布區(qū)域逐漸縮小[4]，早在1991年就被《中國植物紅皮書》[5]列為稀有種，并在《國家重點保護(hù)野生植物名錄》[6]中被列為國家二級重點保護(hù)野生植物。自然狀態(tài)下，香果樹的種子萌發(fā)及幼苗生長狀況直接影響其種群個體數(shù)量[7]。研究發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度過高會導(dǎo)致香果樹的種子萌發(fā)率顯著下降；而且，香果樹幼苗的需光性隨著植株發(fā)育階段而改變，隨著苗齡增長由喜陰逐漸轉(zhuǎn)為喜光[8]。大田實驗表明：香果樹1年生幼苗在全光照條件下生長緩慢，并出現(xiàn)掉葉現(xiàn)象甚至死亡[9]；2年生香果樹幼苗雖然能夠基本適應(yīng)全光照環(huán)境，但適度遮光更有利于其生長[10]。比較而言，林窗中的香果樹幼苗生長最快，生物量最大，更適宜香果樹幼苗生存；而林緣(光照強(qiáng)度過大)和林冠(光照強(qiáng)度過弱)中的香果樹幼苗生長緩慢，成活率低[3,8,11]。因此，探究香果樹的高光適應(yīng)機(jī)制對于揭示其瀕危機(jī)制具有重要價值，對于香果樹合理保育措施的制訂及種群恢復(fù)也具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，高光脅迫可導(dǎo)致香果樹葉片的凈光合速率、PSⅡ活性、最大光化學(xué)效率、實際光化學(xué)效率、非光化學(xué)猝滅系數(shù)、光化學(xué)猝滅系數(shù)、調(diào)節(jié)性能量耗散和相對電子傳遞速率等葉綠素?zé)晒鈪?shù)顯著降低，而非調(diào)節(jié)性能量耗散則顯著升高[12]。為了探明香果樹應(yīng)對高光脅迫的分子機(jī)制，筆者對對照和高光脅迫(光照強(qiáng)度分別為54和180 μmol·m-2·s-1)下香果樹幼苗葉片的凈光合速率、光合作用相關(guān)酶活性、抗氧化酶活性、激素水平、次生代謝物含量進(jìn)行比較，利用RNA-seq技術(shù)對高光脅迫下香果樹幼苗的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG代謝通路分析，對光合作用、花青素代謝、抗氧化酶以及脫落酸(ABA)代謝和信號通路相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，并采用qRT-PCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

將香果樹組培苗種植于裝有V(草炭)∶V(珍珠巖)=2.5∶1.0混合基質(zhì)的花盆(上口邊長10.0 cm、下口邊長7.0 cm、高度8.5 cm)中，置于DRXM-508光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度54 μmol·m-2·s-1、光照時間12 h·d-1、溫度25 ℃、空氣相對濕度70%，每7 d澆1次水。在上述條件下培養(yǎng)至幼苗長出6枚葉時，選取株高約15 cm、生長狀態(tài)較為一致的植株進(jìn)行高光脅迫實驗。

1.2 方法

1.2.1 高光脅迫處理 將供試香果樹組培苗分為2組，每組12株，在其他培養(yǎng)條件不變的情況下，一組繼續(xù)置于光照強(qiáng)度54 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)，即對照組；另一組則置于光照強(qiáng)度180 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)，即高光脅迫組。培養(yǎng)48 h后，采樣并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定分析。

1.2.2 生理生化指標(biāo)測定 每組隨機(jī)選取3株植株，采用LI-6400XT便攜式光合作用測定儀(美國LI-COR公司)測定植株中部的1對對生葉的凈光合速率，測定時，葉室光源采用紅藍(lán)光源，葉室內(nèi)氣流速率為500 μmol·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1。

凈光合速率測定結(jié)束后，采集植株中部的1對對生葉，混勻后取樣測定各生理生化指標(biāo)，每個指標(biāo)重復(fù)取樣檢測3次。參照Hao等[12]的方法測定葉片的葉綠素和花青素含量；參照Song等[13]的方法測定葉片的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性；采用核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，產(chǎn)品編號BC0440)測定葉片的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性；參照陳霞等[14]的方法測定ABA含量。

1.2.3 差異表達(dá)基因篩選及功能分析 每組隨機(jī)選取6株植株，分別取植株中部的1對對生葉，即為6個生物學(xué)重復(fù)，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序工作由上海中科新生命生物科技有限公司完成。采用Trizol(美國Invitrogen公司)提取葉片總RNA，樣品檢測合格后用于cDNA文庫的構(gòu)建，使用Illumina HiSeq平臺(美國Illumina公司)將構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行測序。對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除低質(zhì)量序列、接頭污染及N比例大于5%的reads等處理，得到高質(zhì)量的有效測序數(shù)據(jù)(clean reads)；使用Trinity軟件(https:∥trinityrnaseq.sourceforge.net/)對clean reads 進(jìn)行denovo組裝，獲得unigenes；使用DESeq2軟件[15]進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為︱log2FC︱>1、P-adjust<0.05，其中，F(xiàn)C為差異倍數(shù)(fold change)；對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG代謝通路富集分析。

1.2.4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證 采用與轉(zhuǎn)錄組測序相同的植物材料，隨機(jī)選擇8個差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，驗證轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果的可靠性。使用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)預(yù)測基因的CDS序列設(shè)計熒光定量特異性引物，以香果樹GAPDH基因(TRINITY_DN54866_c2_g1)作為內(nèi)參基因，候選基因的引物序列見表1。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用Thermo Fisher QuantStudioTM1 Plus熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積20.0 μL，包括SybrGreen qPCR Master Mix 10.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.4 μL、cDNA模板2.0 μL，用ddH2O將擴(kuò)增體系體積補(bǔ)足至20.0 μL。

表1 用于香果樹差異表達(dá)基因qRT-PCR驗證的引物序列

擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s，共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量，并換算成log2FC，以便與RNA-seq檢測分析結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)和Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 高光脅迫下香果樹葉片生理生化指標(biāo)的變化

檢測結(jié)果(表2)表明：與對照(光照強(qiáng)度54 μmol·m-2·s-1)相比，高光脅迫(光照強(qiáng)度180 μmol·m-2·s-1)下香果樹葉片的凈光合速率、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性和葉綠素含量均顯著下降，降幅分別為48.44%、26.69%和35.71%；花青素含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性、過氧化氫酶活性、抗壞血酸過氧化物酶活性和脫落酸含量顯著升高，增幅分別為56.25%、10.14%、52.66%、35.57%、34.06%和1 116.46%。

2.2 高光脅迫下香果樹差異表達(dá)基因篩選及功能分析

2.2.1 差異表達(dá)基因篩選 統(tǒng)計結(jié)果表明：與對照(光照強(qiáng)度54 μmol·m-2·s-1)相比(光照強(qiáng)度180 μmol·m-2·s-1)，高光脅迫下香果樹含有6 776個差異表達(dá)基因，其中，上調(diào)差異表達(dá)基因有3 063個，下調(diào)差異表達(dá)基因有3 713個。

表2 高光脅迫下香果樹葉片生理生化指標(biāo)的變化1)

2.2.2 GO功能富集分析 上調(diào)差異表達(dá)基因的GO功能富集分析結(jié)果顯示：上述上調(diào)差異表達(dá)基因富集到的GO功能條目共有2 022個，其中顯著富集的GO功能條目有196個，分為生物過程(97個)、分子功能(70個)和細(xì)胞組分(29個)3類。各類型中富集程度排名前10的GO功能條目見表3。由表3可見：在生物過程中，富集到氧化還原過程的上調(diào)差異表達(dá)基因最多(155個)；在分子功能中，被富集到氧化還原酶活性的上調(diào)差異表達(dá)基因最多(196個)，富集到裂解酶活性的上調(diào)差異表達(dá)基因較多(48個)；在細(xì)胞組分中，富集到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)部分、質(zhì)體和葉綠體的上調(diào)差異表達(dá)基因均較多，分別有352、299、206和179個，且富集到其余條目的上調(diào)差異表達(dá)基因均超過30個。

下調(diào)差異表達(dá)基因的GO功能富集分析結(jié)果顯示：上述下調(diào)差異表達(dá)基因富集到的GO功能條目共有1 835個，其中顯著富集的GO功能條目有129個，分為生物過程(76個)、分子功能(39個)和細(xì)胞組分(14個)3類。各類型中富集程度排名前10的GO功能條目見表4。由表4可見：在生物過程中，富集到磷酸化、核酸模板轉(zhuǎn)錄、RNA生物合成過程、DNA模板轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)磷酸化的下調(diào)差異表達(dá)基因均超過150個，富集到其余條目的下調(diào)差異表達(dá)基因有115～117個；在分子功能中，富集到轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性(轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán))、催化活性(作用于蛋白質(zhì))、激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(以醇基為受體)、蛋白激酶活性及DNA結(jié)合的下調(diào)差異表達(dá)基因均超過150個，富集到其余條目的下調(diào)差異表達(dá)基因有69～95個；在細(xì)胞組分中，富集到膜的下調(diào)差異表達(dá)基因最多(718個)，富集到MCM復(fù)合物的下調(diào)差異表達(dá)基因相對最少(僅4個)，被富集到其余條目的下調(diào)差異表達(dá)基因有19～30個。

表3 高光脅迫下香果樹上調(diào)差異表達(dá)基因的GO功能富集分析1)

表4 高光脅迫下香果樹下調(diào)差異表達(dá)基因的GO功能富集分析1)

2.2.3 KEGG代謝通路富集分析 差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析結(jié)果(表5)表明：上述上調(diào)差異表達(dá)基因顯著富集到15條代謝通路中，共包含353個上調(diào)差異表達(dá)基因。其中，富集到代謝途徑的上調(diào)差異表達(dá)基因最多(122個)，富集到次生代謝物生物合成的上調(diào)差異表達(dá)基因次之(83個)，富集到抗生素生物合成、光合作用、碳代謝、長壽調(diào)解途徑-蠕蟲、類黃酮生物合成及卟啉和葉綠素代謝的上調(diào)差異表達(dá)基因有10～29個，而富集到光合生物的碳固定、類胡蘿卜素生物合成、苯丙氨酸代謝及硫胺代謝等7個代謝通路的上調(diào)差異表達(dá)基因較少(均低于10個)。

由表5還可見：上述下調(diào)差異表達(dá)基因僅顯著富集到5條代謝通路中，共包含86個差異表達(dá)基因。其中，富集到植物-病原體相互作用、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和MAPK信號途徑-植物的下調(diào)差異表達(dá)基因相對較多，分別有29、28和18個，富集到間隙連接和油菜素甾醇生物合成的下調(diào)差異表達(dá)基因較少，分別只有7和4個。

2.3 高光脅迫下香果樹差異表達(dá)基因的表達(dá)分析

2.3.1 光合作用相關(guān)差異表達(dá)基因分析 高光脅迫下香果樹光合作用相關(guān)差異表達(dá)基因分析結(jié)果(表6)顯示：編碼光系統(tǒng)Ⅰ中捕光復(fù)合物(LHCⅠ)的基因lhca4以及編碼光系統(tǒng)Ⅰ中反應(yīng)中心蛋白的基因psaA、psaE、psaG、psaH、psaK、psaL和psaO的表達(dá)水平均顯著下降；編碼光系統(tǒng)Ⅱ中捕光復(fù)合物(LHCⅡ)的基因lhcb1、lhcb2和lhcb5以及編碼光系統(tǒng)Ⅱ中相關(guān)蛋白的基因psbC、psbK、psbO、psbP、psbQ、psbR和psbW的表達(dá)水平均顯著下降。此外，編碼細(xì)胞色素b6f復(fù)合物的基因petA、petC和petG，編碼光合電子傳遞鏈成員質(zhì)體藍(lán)素的基因petE，編碼ATP合成酶的基因atpC1和atpI的表達(dá)水平均顯著下降；編碼核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大、小亞基的基因rbcL和RBCS以及編碼核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的基因RCA的表達(dá)水平顯著下降；編碼葉綠素合成關(guān)鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶和原葉綠素酸酯氧化還原酶A的基因HEMA1和PORA的表達(dá)水平也顯著下降。僅編碼光系統(tǒng)Ⅱ中22 ku蛋白的psbS基因以及編碼ATP合成酶α亞基的atpA基因和ATP合成酶δ鏈的atpD基因的表達(dá)水平顯著上升。

表5 高光脅迫下香果樹差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析

表6 高光脅迫下香果樹光合作用相關(guān)差異表達(dá)基因分析

續(xù)表6 Table 6(Continued)

2.3.2 花青素合成相關(guān)差異表達(dá)基因分析 高光脅迫下香果樹花青素合成相關(guān)差異表達(dá)基因分析結(jié)果(表7)顯示：編碼花青素合成關(guān)鍵酶的基因PAL、CHS、F3H、UFGT6和UFGT3的表達(dá)水平均顯著上升，同時，編碼花青素合成轉(zhuǎn)錄因子的基因MYB6、MYB7、MYB8、MYB12、MYB36、MYB111、MYB113和GL3的表達(dá)水平也顯著上升。

表7 高光脅迫下香果樹花青素合成相關(guān)差異表達(dá)基因分析

2.3.3 抗氧化酶相關(guān)差異表達(dá)基因分析 高光脅迫下香果樹抗氧化酶差異表達(dá)基因分析結(jié)果(表8)顯示：Fe-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT1、CAT2、CAT3、PER2、PER12、PER48、APX1和APX3基因的表達(dá)水平均顯著上升。

2.3.4 脫落酸合成及信號通路相關(guān)差異表達(dá)基因分析 高光脅迫下香果樹脫落酸合成及信號通路相關(guān)差異表達(dá)基因分析結(jié)果(表9)顯示：NCED1和NCED3基因的表達(dá)水平顯著下降，BGLU11、BGLU23、BGLU24、BGLU34和BGLU46基因的表達(dá)水平顯著上升，而催化脫落酸分解的關(guān)鍵酶8′-羥化酶基因CYP707A的表達(dá)水平顯著下降。另外，編碼脫落酸受體PYR/PYL蛋白家族的基因PYR/PYL以及對脫落酸信號通路起正向調(diào)控作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2C的編碼基因SnRK2C的表達(dá)水平顯著上升，而對脫落酸信號通路起負(fù)向調(diào)控作用的蛋白磷酸酶2C 51的編碼基因PP2C51的表達(dá)水平卻顯著下降。

表8 高光脅迫下香果樹抗氧化酶相關(guān)差異表達(dá)基因分析

表9 高光脅迫下香果樹脫落酸合成及信號通路相關(guān)差異表達(dá)基因分析

2.4 高光脅迫下香果樹差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證

為驗證基于RNA-seq技術(shù)檢測的香果樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，從上述差異表達(dá)基因中隨機(jī)選擇8個顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行qRT-PCR驗證。統(tǒng)計結(jié)果(表10)表明：在RNA-seq檢測結(jié)果中，這8個差異表達(dá)基因的表達(dá)水平與qRT-PCR檢測結(jié)果一致，說明基于RNA-seq技術(shù)的香果樹差異表達(dá)基因表達(dá)水平分析結(jié)果真實、可靠。

表10 基于RNA-seq和qRT-PCR技術(shù)的高光脅迫下香果樹8個差異表達(dá)基因表達(dá)水平的比較

3 討論和結(jié)論

3.1 香果樹響應(yīng)高光脅迫的光合通路分析

捕光復(fù)合物(light harvesting complex, LHC)是一種特殊的蛋白質(zhì)，在植物進(jìn)行光合作用的過程中發(fā)揮著吸收和傳遞光能的重要功能。通常認(rèn)為，LHCⅠ包括Lhca1、Lhca2、Lhca3和Lhca4蛋白，LHCⅡ包括Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4(CP29)、Lhcb5(CP26)和Lhcb6(CP24)蛋白[16,17]。其中，CP29、CP26和CP24除了收集太陽能并將其轉(zhuǎn)移到反應(yīng)中心外，還可以在高光照條件下耗散多余的激發(fā)能，起到光保護(hù)作用[18]。在高光脅迫下，擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕Lhca1-4和Lhcb1-6基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)[19]，香果樹Lhca4、Lhcb1、Lhcb2和Lhcb5基因的表達(dá)水平也顯著下調(diào)。據(jù)此推測，高光脅迫可能導(dǎo)致香果樹部分捕光復(fù)合物數(shù)量減少，致使葉綠體的捕光能力下降，相關(guān)光保護(hù)能力也同時降低。

本研究結(jié)果顯示：在高光脅迫下，編碼香果樹光系統(tǒng)Ⅰ中反應(yīng)中心蛋白的基因psaA、psaE、psaG、psaH、psaK、psaL和psaO的表達(dá)水平顯著下調(diào)，這一研究結(jié)果與擬南芥的相關(guān)研究結(jié)果一致[19]。最新研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體NADP庫的大小隨光照強(qiáng)度變化而改變，葉綠體可根據(jù)NADP庫的大小調(diào)整PsaA和PsaB蛋白的合成速率，從而改變光系統(tǒng)Ⅰ的數(shù)量和活性，并且PsaA和PsaB蛋白合成的調(diào)控是在蛋白質(zhì)翻譯階段而不是轉(zhuǎn)錄階段[20]。那么，高光脅迫下香果樹反應(yīng)中心蛋白轉(zhuǎn)錄水平下降與光系統(tǒng)Ⅰ數(shù)量和活性的變化究竟有何直接關(guān)系，尚待進(jìn)一步深入研究。

在光系統(tǒng)Ⅱ中，psbB和psbC基因編碼的核心天線復(fù)合物CP47和CP43以及PsbO、PsbP、PsbQ、PsbR均與光系統(tǒng)Ⅱ的放氧活性密切相關(guān)[21]，PsbK和PsbW對光系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起到關(guān)鍵作用[22]；PsbS在qE型非光化學(xué)猝滅中起重要作用，可保護(hù)植物免受過量光照引起的光損害[23]。本研究中，高光脅迫下，香果樹的psbC、psbK、psbO、psbP、psbQ、psbR和psbW基因的表達(dá)水平顯著下降，而psbS基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明高光脅迫抑制了光系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)蛋白和放氧復(fù)合物核心蛋白的表達(dá)，同時激活了光損傷保護(hù)機(jī)制。最近研究證實，光系統(tǒng)Ⅱ是植物光損傷的關(guān)鍵部位，過量光照導(dǎo)致放氧活性中心蛋白的氧化損傷和放氧活性喪失，核心蛋白亞基D1、D2、CP47和CP43發(fā)生明顯的降解和解離[24]。然而，關(guān)于香果樹光損傷的分子機(jī)制尚未明確，應(yīng)將轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)合起來進(jìn)行研究。

高光脅迫下，香果樹細(xì)胞色素b6f復(fù)合物基因petA、petC和petG，質(zhì)體藍(lán)素基因petE以及ATP合成酶相關(guān)基因atpC1和atpI的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，表明高光脅迫下香果樹的光合電子傳遞過程和光合磷酸化過程均受到影響。對高光脅迫下擬南芥的研究結(jié)果顯示：其細(xì)胞色素b6f復(fù)合物基因petM的表達(dá)水平顯著下調(diào)，但ATP合成酶基因的表達(dá)水平并沒有發(fā)生明顯變化[19]。表明不同植物種類對高光脅迫的響應(yīng)機(jī)制存在差異。

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶是光合作用碳同化過程中的關(guān)鍵酶，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶是調(diào)控核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性的關(guān)鍵酶[25]。在高光脅迫下，香果樹核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大、小亞基的編碼基因以及核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)，推測這可能會造成核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性明顯下降。谷氨酰-tRNA還原酶和原葉綠素酸酯氧化還原酶是葉綠素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[26]，在高光脅迫下，這2種酶相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)可能是造成香果樹葉綠素含量顯著降低的重要原因。

3.2 香果樹響應(yīng)高光脅迫的花青素代謝通路分析

研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光可誘導(dǎo)植物體內(nèi)花青素的積累[27]，而花青素對強(qiáng)光有過濾作用，可減輕光系統(tǒng)Ⅱ的光損傷程度[23,28]。大量研究表明：花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)以及花青素的積累受到MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[29-31]，其中，MYB6、MYB7、MYB8、MYB12、MYB36、MYB111和MYB113可正向調(diào)控擬南芥葉、毛白楊(PopulustomentosaCarr.)葉、紫胡蘿卜〔Daucuscarotasubsp.sativus(Hoffm.) Arcang.〕肉質(zhì)根、月季(RosachinensisJacq.)花瓣、海棠〔Malusspectabilis(Ait.) Borkh.〕葉、丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)花中花青素的合成[19,32-36]；bHLH類轉(zhuǎn)錄因子GL3可促進(jìn)‘紅陽’獼猴桃(Actinidiachinensis‘Hongyang’)果實中花青素的合成[37]。本研究中，高光脅迫下，編碼香果樹花青素合成酶的基因PAL、CHS、F3H、UFGT6和UFGT3的表達(dá)水平顯著上調(diào)，與花青素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因MYB6、MYB7、MYB8、MYB12、MYB36、MYB111、MYB113和GL3的表達(dá)水平也顯著上調(diào)。說明在高光脅迫下，這些轉(zhuǎn)錄因子可能通過對香果樹花青素合成相關(guān)基因表達(dá)的正向調(diào)控來控制花青素的合成，從而使花青素積累顯著增加。前人的研究表明，參與調(diào)節(jié)花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子主要包括3類，即R2R3-MYB、bHLH和WD40，這些轉(zhuǎn)錄因子通常通過形成MYB-bHLH或MYB-bHLH-WD40復(fù)合物來調(diào)控花青素的合成[38]。關(guān)于香果樹中MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間是否存在互作關(guān)系以及二者之間的互作機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

3.3 香果樹響應(yīng)高光脅迫的抗氧化酶系統(tǒng)分析

Hao等[12]認(rèn)為，高光脅迫會導(dǎo)致光系統(tǒng)中的活性氧過度積累，對光系統(tǒng)Ⅱ造成損傷并引起光抑制。植物活性氧的清除主要依賴于體內(nèi)的抗氧化酶(如SOD、POD、CAT和APX等)[24,39]。在高光脅迫下，香果樹SOD、POD、CAT和APX的活性顯著升高，且香果樹Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、CAT1、CAT2、CAT3、PER2、PER12、PER48、APX1和APX3基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。說明香果樹可能通過在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)相關(guān)抗氧化酶基因表達(dá)來調(diào)控抗氧化酶活性，從而提高其清除自由基的能力。

3.4 香果樹響應(yīng)高光脅迫的脫落酸代謝及信號通路分析

脫落酸在植物體內(nèi)的積累不僅與脫落酸的生物合成和分解代謝相關(guān)，也與脫落酸糖基水解酶催化的無活性脫落酸向有活性脫落酸轉(zhuǎn)化的過程有關(guān)[40]。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)是催化脫落酸生物合成的關(guān)鍵酶[41]。CYP707A1、CYP707A2、CYP707A3和CYP707A4這4種細(xì)胞色素P450單加氧酶是脫落酸分解代謝的關(guān)鍵酶[42]。高光脅迫下，盡管香果樹脫落酸合成關(guān)鍵酶基因NCED的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下調(diào)，但是催化無活性脫落酸向有活性脫落酸轉(zhuǎn)化的脫落酸糖基水解酶的基因BGLU顯著上調(diào)表達(dá)，同時催化脫落酸分解的細(xì)胞色素P450單加氧酶基因CYP707A表達(dá)量顯著下調(diào)。說明高光脅迫下香果樹脫落酸水平升高可能是由脫落酸分解速率下降和有活性脫落酸含量增加造成的。

脫落酸是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要信號分子[43]。環(huán)境脅迫可誘導(dǎo)植物體內(nèi)的脫落酸水平升高，脫落酸與其受體PYR1/PYLs結(jié)合后即可啟動脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，ABA-PYR1/PYLs受體復(fù)合物與蛋白磷酸酶2C(PP2C)結(jié)合，從而釋放在靜息狀態(tài)下被PP2C抑制的SnRK2s激酶；SnRK2s被激活后可磷酸化下游的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子(包括ABIs等)，從而激活下游基因，引起植物產(chǎn)生生理生化變化[44]。本研究結(jié)果顯示：高光脅迫下香果樹的脫落酸受體基因PYR/PYL、脫落酸核心信號元件蛋白磷酸酶激酶基因SnRK2C的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而脫落酸信號途徑的負(fù)調(diào)控因子PP2C的編碼基因PP2C51的表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明高光脅迫可促進(jìn)香果樹體內(nèi)脫落酸的積累，進(jìn)而激活脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在對擬南芥的研究中，盡管脫落酸水平受高光脅迫誘導(dǎo)顯著增加，但多數(shù)脫落酸受體基因的表達(dá)量下調(diào)，而幾乎所有的PP2C類磷酸酶基因卻顯著上調(diào)[19]，這與香果樹的研究結(jié)果存在明顯差異?？梢姡撀渌嵴{(diào)控不同植物響應(yīng)高光脅迫的機(jī)制可能存在較大差異。

3.5 結(jié)論

綜上所述，高光脅迫下香果樹的生理生化變化與相關(guān)差異表達(dá)基因的表達(dá)水平變化一致，且這些差異表達(dá)基因主要富集在光合作用、氧化還原、植物激素代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝等通路中，初步推斷香果樹主要通過調(diào)控光合作用、抗氧化酶系統(tǒng)、脫落酸代謝及信號通路、花青素代謝通路響應(yīng)高光脅迫。