朱江，郭森，竇志杰，張弛

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000）

腦卒中又稱腦血管意外，是一種常見的急性腦血管疾病，一般分為缺血性卒中和出血性卒中，具有較高的發(fā)病率、病死率和致殘率[1]。近年來腦卒中發(fā)病率呈上升趨勢，且逐漸年輕化[2]。臨床上以溶栓和機(jī)械取栓為腦卒中的主要治療手段，取栓后雖然能恢復(fù)腦組織血液灌注，但是缺血造成的腦神經(jīng)損傷卻無法修復(fù)，因此多數(shù)患者預(yù)后不良，伴有不同程度的身體殘疾[3]。既往研究結(jié)果顯示，在及時(shí)有效的治療下，中樞神經(jīng)元可以再生，腦組織損傷或可逆[4]。鹽酸納美芬是阿片受體拮抗劑，具有抗休克、腦保護(hù)和治療脊髓損傷等作用。既往研究結(jié)果顯示，鹽酸納美芬可以減少七氟烷麻醉大鼠神經(jīng)元凋亡，提高認(rèn)知能力[5]。目前關(guān)于鹽酸納美芬對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）神經(jīng)保護(hù)作用的報(bào)道很少，因此本研究采用鹽酸納美芬預(yù)注射，探究其對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用，以期為臨床治療腦卒中提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體重（220±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（冀）2021-004。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正常飼養(yǎng)供水。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑鹽酸納美芬注射液（1 mg/mL，國藥準(zhǔn)字H20080652，遼寧海思科制藥有限公司），大鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（批 號(hào)：ml077379）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）ELISA 試劑盒（批 號(hào)：ml077384）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號(hào)：C1091，上海碧云天生物科技有限公司），腦組織蛋白提取試劑盒（批號(hào)：ml077391，上海酶聯(lián)生物科技有限公司），Caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH 兔抗大鼠一抗、羊抗兔HRP 標(biāo)記二抗（美國Abcam 公司）。

1.2.2 主要儀器光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），酶標(biāo)分析儀（美國Thermo 公司），Sigma 3-18K臺(tái)式速冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司），Tissuelyser Ⅱ高通量組織研磨儀（德國Qiagen 公司），Gel Doc 凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 MCAO/R 模型的復(fù)制采用線栓法復(fù)制MCAO/R）模型[6]，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，側(cè)臥固定于手術(shù)臺(tái)上，在頸部右側(cè)做長約2 cm 切口，鈍性分離頸總動(dòng)脈（common carotid artery,CCA）與鄰近肌肉和神經(jīng)，暴露頸外動(dòng)脈（external carotid artery,ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery,ICA），結(jié)扎CCA、ECA，動(dòng)脈夾夾緊ICA，用眼科剪在ECA 與ICA 分叉處做1 mm 切口，置入外科手術(shù)尼龍線并輕輕向內(nèi)推進(jìn)，直至遇到明顯阻力，則表明尼龍線已經(jīng)到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始端，固定尼龍線。缺血2 h后，緩慢抽出尼龍線約10 min 形成缺血再灌注損傷，逐層縫合切口。整個(gè)過程中大鼠置于37℃恒溫箱中保持體溫。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥將36 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組，各12 只。鹽酸納美芬組大鼠復(fù)制MCAO/R 模型前10 min 尾靜脈注射20 μg/kg 鹽酸納美芬注射液，假手術(shù)組和模型組注射等體積生理鹽水。隨后除假手術(shù)組（不進(jìn)行CCA、ECA 結(jié)扎）外，其余兩組采用線栓法復(fù)制MCAO/R 模型。

1.3.3 神經(jīng)功能評(píng)分MCAO/R 模型復(fù)制完成后，放回鼠籠恢復(fù)24 h，參照Longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)分[7]：正常（無神經(jīng)損傷癥狀）計(jì)0 分；輕度（提尾時(shí)左前爪不張）計(jì)1 分；中度（行走時(shí)向左盤旋）計(jì)2 分；重度（行走困難，向左傾斜）計(jì)3 分；極嚴(yán)重（不能自發(fā)行走）計(jì)4 分。

1.3.4 ELISA檢測腦組織SOD活性、MDA含量神經(jīng)功能評(píng)分后，每組隨機(jī)選取4 只大鼠，立即處死后取頭，迅速于冰上解剖分離大鼠右側(cè)腦組織，加入適量生理鹽水，4℃勻漿腦組織，3 000 r/min離心10 min，取上清液，參照試劑盒說明書加入待測樣本，最后在450 nm 波長下讀取各孔光密度（optical density,OD）值，根據(jù)OD 值計(jì)算SOD 活性、MDA 含量。

1.3.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色觀察腦組織病理變化每組隨機(jī)選取4 只大鼠，腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉麻醉，開胸行主動(dòng)脈插管，用200 mL 生理鹽水快速?zèng)_洗，隨后灌入4%多聚甲醛400 mL 固定，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)切腦組織厚約5 μm。取切片烤干，加二甲苯脫蠟，重復(fù)1次，加乙醇脫苯，重復(fù)1次，洗凈乙醇后常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3.6 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡取1.3.5 中腦組織切片，加入二甲苯脫蠟10 min，重復(fù)1 次。加入無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水沖干凈。滴加不含DNase 的蛋白酶K 20 μg/mL，37℃、20 min。PBS 洗滌3次，除去蛋白酶K。加入內(nèi)源性過氧化物酶強(qiáng)力封閉液，室溫下孵育20 min，滅活切片中的內(nèi)源過氧化物酶，PBS 洗滌3 次。參照TUNEL 試劑盒說明書，配制生物素標(biāo)記液，現(xiàn)用現(xiàn)配。切片上滴加50 μL 生物素標(biāo)記液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗滌1次，再滴加0.2 mL 標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫下孵育10 min。參照試劑盒說明書配制Streptavidin-HRP 工作液 和DAB 顯色液。PBS 洗滌3次，滴加50 μL Streptavidin-HRP 工作液，室溫孵育30 min，滴加0.3 mL DAB顯色液，室溫孵育20 min[8]。PBS 洗滌3次，在顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中凋亡細(xì)胞數(shù)并記錄平均值（視野中棕色為陽性凋亡細(xì)胞）。

1.3.7 Western blotting 檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白的表達(dá)各組隨機(jī)選取4 只大鼠，處死后取頭，于冰上解剖分離右側(cè)腦組織，加入組織蛋白提取液，組織勻漿器勻漿，4℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白20 μg，通過SDS-PAGE 分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%脫脂牛奶封閉后，將PVDF 膜與Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗體在4℃孵育過夜。緩沖液洗膜3次，PVDF 膜與二抗孵育1 h，洗膜3次，顯色液顯色。采用ImageJ軟件定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH 為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用方差分析或t檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠神經(jīng)功能損傷情況

假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分分別為（0.00±0.00）分、（3.14±0.58）分和（2.21±0.41）分。假手術(shù)組分別與模型組、鹽酸納美芬組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.754和18.672，均P=0.000），假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分較低。模型組與鹽酸納美芬組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.536，P=0.000），鹽酸納美芬組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分低于模型組。

2.2 3組大鼠腦組織SOD活性、MDA含量比較

假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠腦組織SOD 活性、MDA 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.211 和15.625，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：模型組、鹽酸納美芬組SOD 活性低于假手術(shù)組（P＜0.05），MDA 含量高于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬組SOD 活性升高（P＜0.05），MDA 含量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠腦組織SOD活性、MDA含量比較（n=4，）

表1 3組大鼠腦組織SOD活性、MDA含量比較（n=4，）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

2.3 3組大鼠腦組織病理變化

假手術(shù)組細(xì)胞輪廓清晰，排列有序。模型組細(xì)胞破損，數(shù)量減少，炎癥浸潤嚴(yán)重。鹽酸納美芬組細(xì)胞數(shù)量較多，輪廓清晰，炎癥浸潤減少（見圖1）。

圖1 3組大鼠腦組織病理變化（HE染色×400）

2.4 3組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較

假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)分別為（4.12±1.07）個(gè)/HP、（52.87±10.54）個(gè)/HP和（30.76±8.57）個(gè)/HP，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=38.508，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：模型組、鹽酸納美芬組凋亡細(xì)胞數(shù)多于假手術(shù)組（P＜0.05）；鹽酸納美芬組凋亡細(xì)胞數(shù)少于模型組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色×200）

2.5 3 組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.871、33.992 和14.459，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：模型組、鹽酸納美芬組Caspase-3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬組Caspase-3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見 表2和圖3。

表2 3組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=4，）

表2 3組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=4，）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

圖3 3組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

3 討論

缺血性腦卒中是腦血管堵塞引起的腦損傷疾病，發(fā)病原因?yàn)榇竽X中動(dòng)脈出現(xiàn)梗死，中斷腦組織供血。即使在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)供血，腦組織也會(huì)受到不同程度的損傷，使腦神經(jīng)功能受損[9]。目前臨床上常采用組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator,t-PA）進(jìn)行血栓溶解[10]，但t-PA有效時(shí)間窗口狹窄（4.5 h 內(nèi)），并且恢復(fù)血液灌注后，受損的腦組織神經(jīng)元難以修復(fù)，因此尋找具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物對(duì)治療腦組織缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)損傷具有重要意義。鹽酸納美芬與其他阿片受體拮抗劑一樣，具有抗昏迷、抗休克等作用。鹽酸納美芬可以透過血腦屏障，注射后可以迅速到達(dá)腦組織，促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)，具有修復(fù)受損神經(jīng)元的作用[11]。既往研究結(jié)果顯示，臨床上治療急性腦梗死時(shí)，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用鹽酸納美芬可以提高療效[12]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)行走困難，并向左傾斜的癥狀，說明右側(cè)腦組織損傷嚴(yán)重；鹽酸納美芬組大鼠行走時(shí)雖向左盤旋，但行走障礙不明顯，說明右腦神經(jīng)功能得到部分修復(fù)。腦組織缺血再灌注過程會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜，損傷神經(jīng)元[13]。MDA 是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物[14]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠MDA 含量升高，說明MCAO/R后，大鼠腦組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平升高，腦組織氧化損傷嚴(yán)重。與模型組相比，預(yù)注射鹽酸納美芬后大鼠腦組織MDA 含量降低。SOD 參與氧自由基的清除，對(duì)抗機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。本研究中，與模型組相比，預(yù)注射鹽酸納美芬的大鼠腦組織SOD 活性升高，說明腦組織抗氧化水平提高。通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，MCAO/R 對(duì)腦組織造成損害，細(xì)胞破損嚴(yán)重，炎癥浸潤增加，而預(yù)注射鹽酸納美芬后，大鼠腦組織炎癥浸潤減少，細(xì)胞數(shù)量增多，提示鹽酸納美芬具有一定腦組織保護(hù)作用。

腦組織缺血時(shí)，神經(jīng)元會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放活性氧（reactive oxygen species,ROS）。ROS 刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C（cytochrome C,Cyt-C），與凋亡蛋白酶激活因子形成聚合物，激活細(xì)胞凋亡終末蛋白Caspase-3，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。Bcl-2 是細(xì)胞中重要的抗凋亡基因，其通過抑制細(xì)胞中蓄積的Cyt-C和Caspase-3，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bax屬于Bcl-2基因家族，過表達(dá)拮抗Bcl-2 形成二聚體，抑制Bcl-2 的保護(hù)作用[16-17]。本研究中，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織Caspase-3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，說明MCAO/R時(shí)腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成腦組織損傷，大量細(xì)胞凋亡。當(dāng)預(yù)注射鹽酸納美芬后，與模型組相比，鹽酸納美芬組大鼠腦組織Caspase-3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，提示鹽酸納美芬可以抑制氧化應(yīng)激發(fā)生，具有神經(jīng)保護(hù)作用；并且通過TUNEL 染色觀察到，相比模型組，鹽酸納美芬組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞減少。

綜上所述，鹽酸納美芬具有抗氧化應(yīng)激作用，可抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)腦神經(jīng)。其作用機(jī)制與調(diào)控Caspase-3/Bcl-1/Bax 通路有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。