蔡良平,劉光蘭
湯臣倍健股份有限公司 (珠海 519040)
泛酸又名維生素B5,化學(xué)式為C9H17NO5,是一種水溶性維生素,因廣泛存在于動(dòng)植物中而得“泛酸”之名。由于所有的食物都含有維生素B5,所以幾乎不存在缺乏問(wèn)題[1,2]。泛酸幾乎存在于所有活細(xì)胞中,且在其細(xì)胞內(nèi)可以通過(guò)酶促反應(yīng)合成。泛酸是體內(nèi)檸檬酸循環(huán)、膽堿乙?;⒑铣煽贵w等代謝所必需的中間物[3,4]。因此,泛酸在體內(nèi)可作用于正常的上皮器官如神經(jīng)、腎上腺、消化道及皮膚,提高動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力[5],維生素B5及其衍生物還可以減輕抗生素等藥物引起的毒副作用,參與多種營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用[6-8]。
目前泛酸的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、微生物法、實(shí)臉動(dòng)物法、放射免疫法[9-11],本次研究則是使用高效液相色譜法,參照J(rèn)JF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[12]及JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》,根據(jù)GB 5009.210—2016[13-15]對(duì)泛酸含量的檢測(cè),并對(duì)其各分量的不確定度進(jìn)行評(píng)估。
泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品(含量97.5%,擴(kuò)展不確定度為1%),SIGMA;乙腈(HPLC),上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?;磷酸二氫?AR),廣東廣試試劑科技有限公司;多種維生素片;一級(jí)水。
1260型高效液相色譜儀(附帶紫外檢測(cè)器),安捷倫科技有限公司;色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),安捷倫科技有限公司;XP205型電子天平,梅特勒-托利儀器有限公司;ELMA P300H型超聲波清洗器,德國(guó)ELMA。
1.2.1儀器條件
色譜柱C18,柱長(zhǎng)250 mm,內(nèi)徑4.6 mm,粒徑5 μm。檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液∶乙腈=95∶5(v/v);流速1.0 mL/min;柱溫28 ℃±0.5 ℃;進(jìn)樣量10 μL。
1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
精密稱取泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品10.27 mg至100 mL容量瓶中,在室溫條件下,用水超聲溶解,放至室溫,定容至刻度,搖勻待用,濃度為0.099 41 mg /mL。
1.2.3供試品溶液配制
取適量以上試樣研磨并混勻,精密稱取0.5 g研磨均勻的樣品,置于具塞錐形瓶中,加入適量的水超聲提取20 min,搖勻,經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾,為待測(cè)供試品溶液。
2.2.4數(shù)學(xué)模型的建立
試樣中泛酸含量的計(jì)算如下:
X=V×C/M×0.92×K
式中:X為試樣中泛酸含量,mg/100 g;M為樣品質(zhì)量,g;V為樣品定容體積,mL;C為樣品濃度,mg/mL;0.92為泛酸鈣轉(zhuǎn)換為泛酸的轉(zhuǎn)換系數(shù);K為為單位轉(zhuǎn)換系數(shù),取值100。
依據(jù)全實(shí)驗(yàn)過(guò)程及圖1所示的不確定度來(lái)源分析,主要有以下幾個(gè)不確定度來(lái)源:試樣重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度ur(x1);標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x2);試樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3);儀器(高效液相色譜儀)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x4);標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x5)。
圖1 泛酸供試品含量測(cè)定的不確定度各分量直觀圖
根據(jù)試驗(yàn)實(shí)際情況,選用線性模型公式,計(jì)算相對(duì)不確定度,合成公式如下:
2.2.1測(cè)量重復(fù)性引入不確定度的測(cè)定
按GB 5009.210—2016第二法對(duì)定值樣品泛酸含量進(jìn)行測(cè)定,重復(fù)測(cè)10次,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。此重復(fù)測(cè)量屬于A類不確定度。
表1 多種維生素片樣品中泛酸的含量重復(fù)測(cè)定10次結(jié)果
按貝賽爾公式計(jì)算出試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為:
在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中,測(cè)定供試品中泛酸含量2次時(shí),取算術(shù)平均值為其檢測(cè)結(jié)果,所以重復(fù)性測(cè)定引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
2.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度的測(cè)定
3.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量本身引入的不確定度ur(x3.3.2.1)
3.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在稱量過(guò)程中引入的不確定度ur(x3.3.2.2)
3.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋和定容過(guò)程引起的不確定度ur(x3.3.2.3)
經(jīng)分析評(píng)估,溶液定容主要引入的不確定度為:50 mL容量瓶(A級(jí))。環(huán)境溫度和玻璃容器對(duì)液體的體積有影響,會(huì)導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制過(guò)程中的偏差。按均勻分布及最大允許誤差來(lái)處理,K為包含因子,分別計(jì)算各分量的不確定度。
3.3.2.3.1 50 mL單標(biāo)線容量瓶校準(zhǔn)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3.3.2.3.1)
其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:ur(x3.3.2.3.1)=0.028 8/50=0.000 576
3.3.2.3.2 校準(zhǔn)溫度、溶液溫度之間的差異引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3.3.2.3.2)
相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:ur(x3.3.2.3.2)=0.261/50=0.005 21
50 mL A級(jí)單標(biāo)線容量瓶的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
由上面分析可得,泛酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
3.3.3泛酸試樣引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度的測(cè)定
3.3.3.1 試樣稱量過(guò)程中引入的不確定度ur(x3.3.3.1)
樣品稱量時(shí)的相對(duì)不確定度為:ur(x3.3.3.1)= 0.000 029 g/0.5=0.000 058 g
3.3.3.2 樣品定容引起的不確定度ur(x3.3.3.2)
溶液稀釋過(guò)程引起的不確定度主要是50 mL容量引入的不確定度。
3.3.3.2.1 50 mL單標(biāo)線容量瓶校準(zhǔn)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3.3.3.2.1)
相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:ur(x3.3.3.2.1)=0.028 9/50=0.000 576
3.3.3.2.2 校準(zhǔn)溫度、溶液溫度之間的差異引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3.3.3.2.2)
相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:ur(x3.3.3.2.2)=0.261/50=0.005 21
50 mL容量瓶產(chǎn)生的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
由上面分析可得,泛酸樣品引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
3.3.4高效液相色譜儀引入不確定度的測(cè)定
高效液相色譜儀引入的不確定度分量評(píng)定ur(x3.3.4)
3.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生不確定度的測(cè)定
表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線信息
標(biāo)準(zhǔn)曲線信息見(jiàn)表2,線性方程為y=mx+b,即y= 4 009.929 26x+0.532 715,相關(guān)系數(shù)(R)為1.000 00。
標(biāo)準(zhǔn)曲線引入不確定的公式如下:
由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表3。根據(jù)各分量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度值,進(jìn)行合成,則有:
表3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表
各測(cè)量不確定度的統(tǒng)計(jì)直方圖如圖2所示。
圖2 各測(cè)量不確定度的統(tǒng)計(jì)直方圖
試樣測(cè)定平均值為388.9 mg/100 g,則泛酸測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ucr(x)=x×ur(x)=19.05×0.026=10.1 mg/100 g
取置信概率p=95%,k=2,擴(kuò)展不確定度等于包含因子與合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的乘積,則泛酸含量的擴(kuò)展不確定度U95=k×ucr(x) =0.052 mg/100 g。因此,本次測(cè)定的泛酸試樣的平均含量為(388.9±20.2) mg/100 g
從各測(cè)量不確定度的統(tǒng)計(jì)直方圖可以看出,試樣中泛酸含量測(cè)定引入的不確定度因素中,影響比較大的則是方法標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制,影響較小的是樣品和色譜儀本身所產(chǎn)生的不確定度。此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程是符合的,提示我們?cè)谑褂么朔椒z測(cè)泛酸含量的過(guò)程中,需注意標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合,選用高級(jí)別容量瓶,同時(shí)還應(yīng)該對(duì)我們的分析天平以及高效液相色譜儀進(jìn)行定期的校準(zhǔn)與維護(hù)保養(yǎng)。并要求檢測(cè)人員熟練掌握方法要求各個(gè)步驟的操作,提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。