司 鵬 ,劉連濤 ,孫紅春 ,張 科 ,白志英 ,李存東 ,張永江**

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/省部共建華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/河北省作物生長調(diào)控重點實驗室 保定 071000;2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 保定 071000)

近年來,CO2、CH4等溫室氣體排放持續(xù)加重,導(dǎo)致全球氣溫呈逐漸上升的趨勢[1]。聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會(IPCC)第5 次綜合報告中指出,全球變暖帶來一系列的氣候問題,例如,極端氣候出現(xiàn)的越來越頻繁,導(dǎo)致熱浪發(fā)生的頻率增加且持續(xù)時間拉長[2]。2018 年,IPCC 的工作組特別報道中指出全球氣溫較工業(yè)化前上升1.5 ℃已經(jīng)成為不爭的事實[3]。棉花(Gossypiumspp.)屬于喜溫好光作物,但是超過一定耐受溫度(通常認(rèn)為是35 ℃)仍會導(dǎo)致高溫脅迫。有研究表明,高溫脅迫下,日最高溫度每升高1 ℃會導(dǎo)致皮棉產(chǎn)量減少110 kg·hm-2[4]。隨著全球氣溫上升,高溫脅迫已經(jīng)成為限制棉花生長發(fā)育的重要非生物脅迫之一[5-6]。因此,培育耐高溫的棉花品種對未來棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的提升至關(guān)重要。確定棉花耐高溫品種特性,可為耐高溫品種育種工作提供依據(jù)。

棉花花芽分化是從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的過程[7],此時易受高溫脅迫的影響,六葉期處于棉花營養(yǎng)生長向生殖生長過渡,此時遭受高溫脅迫對生殖生長不利[8]。高溫脅迫下,棉花細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),造成氧化脅迫[9],激發(fā)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)等活性氧清除系統(tǒng)酶類活性[10],從而降低高溫傷害。高溫脅迫下抗氧化物質(zhì)的活性強弱可用來判斷棉花的耐熱性強度[11-13]。高溫脅迫使細(xì)胞膜上的蛋白變性[14],破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),改變細(xì)胞膜的透性,同時丙二醛(malondialdehyde,MDA)也會加劇膜損傷,使細(xì)胞液外漏,電解質(zhì)大量外滲,相對電導(dǎo)率(relative conductance,RC)增加,這些與植株的耐熱性密切相關(guān)。耐熱品種可通過調(diào)控可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量,緩解滲透壓的增加帶來的傷害[15-16]。早在1994 年就有報道表明,在棉花苗期耐熱性強的品種可溶性糖(soluble saccharide,SS)含量更高[17],但脯氨酸含量等沒有明顯變化規(guī)律[18]。

在適宜的溫度范圍內(nèi),溫度和光合速率呈正相關(guān),但當(dāng)溫度脅迫超過自身可調(diào)節(jié)范圍時,凈光合速率降低,呼吸作用會增強,導(dǎo)致同化產(chǎn)物的生成速率降低[5]。棉花高溫脅迫時,葉片凈光合速率(photosynthetic rate,Pn)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance,Gs)、胞間二氧化碳濃度(intercellular CO2concentration,Ci)和蒸騰速率(transpiration rate,Tr)隨著脅迫時間的延長而下降[19]。高溫脅迫下,棉花的耐熱性越強,光合作用降低的幅度越小[20]。高溫脅迫會導(dǎo)致葉綠體外膜和類囊體膜結(jié)構(gòu)的破壞,促使葉綠素降解,含量下降,因此常用來鑒定植物的耐熱性。葉綠素?zé)晒鈪?shù)PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)在非脅迫條件下變化較小,但經(jīng)過脅迫條件后下降明顯[21-23],也是植物耐熱性的關(guān)鍵指標(biāo)。

前人研究多側(cè)重于高溫脅迫對作物地上部的影響,對地下部根系的報道并不多見。根系是植株水分和養(yǎng)分吸收的關(guān)鍵器官,在遭受高溫脅迫后,植物的根表面積、根長和根體積顯著降低,根尖和根叉的數(shù)量增加[24];根生物量、根冠比、初生根長度、根表面積和根體積顯著降低[25]。但高溫脅迫下棉花根系表型特征與耐高溫能力關(guān)系尚缺乏報道。本文選用黃河流域棉區(qū)15 個主栽的棉花品種,在正常和高溫條件下,研究了葉片的10 個生理指標(biāo)和4 個根系表型性狀對高溫的響應(yīng)特征,通過主成分分析和相關(guān)分析,篩選耐高溫的品種,解析耐高溫能力與根系表型性狀關(guān)系,為深入探究棉花耐熱機理和品種改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

供試品種為冀中南棉區(qū)生產(chǎn)上常見的15 個品種,所有品種均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)光溫高效利用實驗室提供。品種及編號如表1 所示。

表1 供試棉花品種及編號Table 1 Cotton cultivars tested in this study

試驗在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室內(nèi)進行。選取飽滿一致的種子經(jīng)消毒沖洗后放置于濕潤的毛巾上,在GXZ-430B 智能型培養(yǎng)箱(浙江,寧波)中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為25 ℃,暗培養(yǎng)24 h。選取萌發(fā)程度一致的種子,播種至直徑15 cm、高13 cm 的培養(yǎng)缽中。培養(yǎng)基質(zhì)按耕層土∶營養(yǎng)土=3∶1 的體積比進行摻混。每個品種種植10 個培養(yǎng)缽,每缽播3 粒種子,子葉展開后每缽留1 株,一半對照組(CK),另一半為高溫組(HT)。出苗后保持基質(zhì)中的相對含水量為(70±5)%,溫室內(nèi)環(huán)境參數(shù)設(shè)置如下: 晝夜時長12 h/12 h,晝夜溫度25 ℃/25 ℃,光照強度為500 μmol·m-2·s-1。待植株生長至6 葉期,對照組(CK)繼續(xù)保持原有培養(yǎng)條件,高溫組(HT)進行高溫處理,晝夜溫度設(shè)置為35 ℃/30 ℃,其他條件與CK 保持一致,高溫處理持續(xù)7 d。

1.2 測定項目與方法

處理7 d 后,選取長勢一致的3 棵植株。選擇主莖倒3 葉,用葉綠素儀(SPAD-502,日本)測定SPAD值,用便攜式光合儀(LI-6400xt,美國)測定凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr),用植物效率分析儀(Handy PEA,英國)測定PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。

取下主莖倒3 葉,先用去離子水沖洗葉片3 次,用吸水紙吸干,剪成長條狀,黑暗條件下浸泡在10 mL去離子水中24 h,用電導(dǎo)率儀(雷磁DDS-307,中國)測得葉片的電導(dǎo)率R1;沸水浴30 min 后拿出,待恢復(fù)室溫后,測得電導(dǎo)率R2,計算相對電導(dǎo)率RC=R1/R2。之后稱取一定重量的葉片暫存在液氮后并轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中,然后采用南京建成生物工程研究所有限公司的試劑盒測定SOD、POD、CAT 和SS。

將葉片取樣完畢后,在子葉節(jié)處剪斷,將地下部土壤沖洗干凈,根系無重疊擺放在含1 cm 水深的亞克力透明盒中,采用愛普生掃描儀(Epson Expression 10000XL,日本)掃描根系,獲得300 dpi 根系圖像,然后用 WinRHIZO 軟件(WinRHIZO Reg2009,加拿大)進行自動分析,獲取根長(RL)、根表面積(RSA)、根體積(RV)和根平均直徑(RAD)。

為驗證結(jié)果的可靠性,將篩選出的耐高溫品種和不耐高溫的品種進行驗證試驗。試驗前期條件與篩選試驗一致,處理時期同為六葉期。白天進行35 ℃的高溫處理,夜晚恢復(fù)25 ℃,處理一周后測定倒3葉Pn、Fv/Fm、CAT 和MDA 等耐高溫代表性指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2016 和IBM SPSS Statistics 24 軟件。利用主成分分析法(Principal Component Analysis,PCA)計算各個品種耐高溫的綜合評價得分,得分越高代表耐熱性越強,再根據(jù)綜合得分進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對不同棉花品種生理指標(biāo)的影響

不同棉花品種在不同溫度處理下各生理指標(biāo)表現(xiàn)如表2 所示。高溫處理后,SOD、POD、CAT、SS 和RC 總體上升,Pn、Gs、Tr、Fv/Fm和SPAD 總體下降。對于增加的5 個指標(biāo),所有品種高溫處理均比常溫對照處理平均分別增加199.2%、99.3%、81.1%、14.1%和8.3%,表明RC 對高溫響應(yīng)相對較敏感;對于降低的5 個指標(biāo),所有品種高溫處理均比常溫對照處理平均分別降低62.0%、60.7%、30.8%、23.0%和7.6%,表明Tr對高溫響應(yīng)相對較敏感。不同品種間各個指標(biāo)表現(xiàn)各不相同。對于RC,高溫處理比常溫處理增幅最大的品種為‘冀228’,增幅最小品種為‘魯棉研28’;對于Tr,高溫處理比常溫處理降幅最大的品種為‘農(nóng)大601’,降幅最小的品種為‘冀228’。僅進行指標(biāo)間的對比,難以得出高溫處理后變化規(guī)律一致的品種。

2.2 高溫脅迫下棉花生理指標(biāo)的PCA 評價

本試驗共涉及10 個相關(guān)指標(biāo),對這10 個指標(biāo)的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析,由表3 可知,高溫處理下Pn和Gs與POD 相關(guān)性較差,Tr與SOD、POD、CAT和SS 的相關(guān)性較差,其余指標(biāo)間均顯著或極顯著相關(guān)(P＜0.05,P＜0.01)。SOD、POD、CAT、SS 和RC是反映植物細(xì)胞內(nèi)受損傷程度的指標(biāo),Pn、Gs、Tr、Fv/Fm和SPAD 則是反映植物光合生理的指標(biāo)。為了方便數(shù)據(jù)處理,結(jié)合高溫處理后不同指標(biāo)的變化趨勢,對這10 個指標(biāo)進行降維處理,分為兩部分: 一部分為SOD、POD、CAT、SS 和RC,稱為綜合指標(biāo)1;一部分為Pn、Gs、Tr、Fv/Fm和SPAD,稱為綜合指標(biāo)2。

表3 高溫處理下棉花生理指標(biāo)相關(guān)性Table 3 Correlation of physiological parameters of cotton under high temperature treatment

主成分分析可以用較少的變量解釋大部分變量,將多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個指標(biāo)。通過主成分分析分別得到對照和高溫處理下兩組綜合指標(biāo)值計算表達(dá)式:

式中:x0-x9分別代表SOD、POD、CAT、SS、RC、Pn、Gs、Tr、Fv/Fm、SPAD。由表4 可知,KMO 檢驗值全部大于0.7,KMO 值越接近1,意味著變量間的相關(guān)性越強,原有變量越適合作因子分析;累計貢獻率分別為80.762%、63.77%、75.942%和78.739%,除了高溫脅迫下的綜合指標(biāo)1 累計貢獻率較低外,另外3 個綜合指標(biāo)的累計貢獻率都在75%以上,說明能夠較好地反映主體信息。這2 組綜合指標(biāo)4 個表達(dá)式中,每個系數(shù)的值相差不大,表明在綜合指標(biāo)中所占的重要性相差不大。將各對照和高溫處理的原始數(shù)據(jù)帶入公式中,即可得對照和高溫兩組綜合指標(biāo)值(表4)。

表4 正常溫度(CK)和高溫脅迫(HT)條件下棉花的兩個綜合指標(biāo)主成分分析Table 4 Principal component analysis of two comprehensive indexes of cotton under normal (CK) and high temperature (HT)treatments

2.3 不同棉花品種的耐熱綜合評價及篩選

綜合指標(biāo)1 和2 的HT 與CK 的比值為耐熱系數(shù),耐熱系數(shù)有2 組,為了進行聚類分析,對耐熱系數(shù)1、2 再次進行PCA 分析,最后得出各品種得分(表5)?！T豐1 號’品種得分最高,為5.64,表明在這15 個品種中耐熱性最強;‘農(nóng)大601’品種得分為1.62,在這15 個品種中耐熱性最弱。根據(jù)品種得分進行系統(tǒng)聚類分析(圖1),將15 個品種對高溫的耐受程度分為3 種類型,第1 類為高溫耐受性較強的品種:‘碩豐1 號’ ‘國欣9 號’和‘魯棉研28’;第2 類為高溫耐受性較弱的品種: ‘石抗126’ ‘邯無216’ ‘國欣4號’ ‘滄棉268’和‘農(nóng)大601’;第3 類為中間型: ‘農(nóng)大棉10’ ‘邯8266’ ‘冀228’ ‘國欣1號’ ‘冀863’ ‘冀棉315’和‘國欣2 號’。

圖1 15 個棉花品種的耐熱性聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis of heat resistance for 15 cotton cultivars

表5 基于主成分分析的棉花耐熱系數(shù)及品種得分Table 5 High temperature resistance coefficients and cultivar scores of cotton based on principal component analysis

2.4 不同棉花品種耐高溫得分與根系表型數(shù)據(jù)之間的關(guān)系

高溫不僅對棉花地上部,也對地下根系產(chǎn)生影響。由表6 可知,高溫處理后,棉花根長、根系表面積等指標(biāo)均有不同程度地降低,其中,根長降低幅度最大的是‘農(nóng)大601’,降幅達(dá)54.2%;降幅最小的是‘碩豐1號’,為16.1%。根表面積、根平均直徑和根體積降幅最大的是‘國欣4號’,降幅分別為61.9%、13.9%和68.5%;根表面積降幅最小的是‘冀棉315’,為7.3%;根平均直徑降幅最小的為‘冀228’,為1.3%,根體積降幅最小的為‘碩豐1號’,為21.4%。將高溫處理下根系表型數(shù)據(jù)與對照的比值與品種得分進行相關(guān)性分析(表7),根長、根表面積、根體積和根平均直徑與品種耐高溫得分的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.766(P＜0.01)、0.659 (P＜0.01)、0.628 (P＜0.05)、0.501(P＞0.05),表明越是耐高溫的品種,根長、根表面積和根體積在遭受脅迫后減小的幅度越低。

表6 不同棉花品種高溫處理下根系表型指標(biāo)Table 6 Root phenotypic indicators of different cotton cultivars under high temperature treatment

表7 高溫與對照棉花根系表型參數(shù)間及其參數(shù)比與品種得分的相關(guān)性Table 7 Correlation between root phenotypic parameters,and between parameter ratio of high and normal temperatures and cultivar score

為了對試驗結(jié)果進行驗證,將篩選出的耐熱品種與不耐熱品種再次進行高溫試驗處理,驗證試驗只在白天增溫到35 ℃,夜晚恢復(fù)25 ℃,1 周后觀測形態(tài)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)耐熱品種的Pn、Fv/Fm和CAT 大于不耐熱品種,除‘滄棉268’的Pn與耐熱品種不顯著,其余指標(biāo)差異均顯著,耐熱品種的MDA 顯著低于不耐熱品種(表8)。

表8 驗證試驗中耐高溫和不耐高溫棉花品種高溫下的生理指標(biāo)值Table 8 Physiological indexes of high temperature-resistant and high temperature-sensitive cultivars of cotton under high temperature in the verification test

3 討論

棉花耐高溫的鑒定方法、檢測指標(biāo)和分析方法較多,至今還沒有統(tǒng)一的鑒定和評價標(biāo)準(zhǔn),前人的研究中取樣時期和測定指標(biāo)較多,因此找到一個快速、高效、科學(xué)的篩選棉花耐高溫的方法至關(guān)重要。其中耐高溫鑒定方法應(yīng)用較多的是花粉離體培養(yǎng)法,雄蕊對溫度較為敏感[25],高溫會使花粉活力降低,花粉萌發(fā)、花粉管伸長受到抑制,甚至完全受阻[25-26],棉花花粉離體培養(yǎng)耐受溫度和萌發(fā)率越高,越能代表該品種具有一定的耐高溫能力,因此常將散粉率和花粉萌發(fā)率作為耐高溫的指標(biāo)[27],但是用此方法需在棉花開花期進行,棉花前期培養(yǎng)的時間較長。本試驗測定取樣時期為苗期,試驗周期較短,利用智能溫室開展試驗,其環(huán)境條件易于控制,較為穩(wěn)定,受其他因素的影響較小,所有指標(biāo)的測定也較為簡便,而且本試驗所有選定的指標(biāo)都有相應(yīng)的文獻做支撐,同時本試驗也可以為之后棉花耐熱篩選提供相關(guān)思路。

已有研究表明,棉花苗期高溫脅迫后,SOD、POD 和CAT 會呈上升的趨勢,RC 顯著增大,光合相關(guān)指標(biāo)降低[11-13,16]。本研究測定了10 個與高溫相關(guān)的指標(biāo),不同品種高溫脅迫活性氧清除酶含量表現(xiàn)不盡一致,例如‘農(nóng)大棉10 號’的SOD 和CAT 在脅迫之后略下降、POD 含量升高,‘石抗126’的POD含量降低、SOD 和CAT 的含量上升,但總體上活性氧清除系統(tǒng)的活性增強。植物體內(nèi)的活性氧產(chǎn)生較復(fù)雜,同時活性氧清除系統(tǒng)的酶種類較多,因此不同品種的SOD、POD 和CAT 表現(xiàn)并不相同。本文還選擇了對高溫脅迫反應(yīng)比較敏感的光合相關(guān)指標(biāo)和細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)相關(guān)指標(biāo),15 個品種的Pn、Tr、Gs和Fv/Fm在高溫脅迫后全部呈降低趨勢,高溫脅迫抑制了棉花光合系統(tǒng)相關(guān)酶活性,可溶性糖含量、相對電導(dǎo)率呈上升的趨勢,表明高溫脅迫破壞了棉花的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),造成了細(xì)胞液外流,同時為了維持細(xì)胞的滲透壓,增加了可溶性糖含量。本試驗的10 個耐熱性指標(biāo)充分客觀地反映了棉花的耐熱性。測得的數(shù)據(jù)經(jīng)過分析后發(fā)現(xiàn),這10 個指標(biāo)有一定的相關(guān)性,因此綜合為兩大類指標(biāo),在衡量耐熱性上還具有一定的局限性,但本試驗隨后對篩選結(jié)果進行了驗證,在驗證試驗中,只在白天進行了高溫處理,耐熱品種和高溫敏感品種在Pn、Fv/Fm、CAT 和MDA 上均有一定的差異,且葉片萎蔫程度相差較大,表明本試驗結(jié)果具有一定的準(zhǔn)確性。

植物地上部和地下部之間是互相聯(lián)系的,在以往的高溫脅迫對棉花影響的研究中多集中于地上部,由于根系深埋在土壤中不利于觀測和取樣,同時土壤溫度總是低于環(huán)境溫度,因此對于高溫脅迫與根系之間的研究內(nèi)容較少,直到近些年才開始由地上研究為主逐漸轉(zhuǎn)向地上地下兼顧[28]。在以往高溫脅迫對根系表型研究的報道中較多為單一品種,本研究選擇黃河流域棉區(qū)推廣的15 個品種,將耐熱性與根系表型數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析,探求棉花耐熱性與根長、根表面積、根體積和根直徑之間的聯(lián)系。根系是作物吸收運輸養(yǎng)分的主要器官,根長、根表面積越大,單位時間吸收的養(yǎng)分就越多,研究發(fā)現(xiàn)耐熱性好的品種如‘碩豐1 號’ ‘國欣9 號’和‘魯棉研28’,在高溫脅迫1 周后根系表型指標(biāo)降低的幅度比不耐熱品種小,耐高溫品種與不耐熱品種相比,在高溫脅迫后,根系吸收養(yǎng)分較多,蒸騰的水分也會更多,也會降低高溫對葉片的損傷。在其他作物中如香菜(Coriandrum sativumL.)和水稻(Oryza sativaL.)的高溫試驗中發(fā)現(xiàn)耐熱的品種根系活力更強[29-30],本文結(jié)果與之一致。在本試驗中將品種的耐熱性得分與根系表型數(shù)據(jù)之間進行了相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)品種的耐高溫能力與根長、根表面積極顯著相關(guān),與根體積顯著相關(guān),因此,根長、根表面積和根體積也可以作為高溫篩選的指標(biāo)。在育種工作中,可以挑選根長、根表面積和根體積相對較大的品種,育成的品種可能具有較強的耐熱能力。

4 結(jié)論

對15 個黃河流域棉花品種研究表明,高溫脅迫導(dǎo)致棉花葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、Fv/Fm和SPAD 值降低;抗氧化酶SOD、POD 和CAT 活性,可溶性糖含量和相對電導(dǎo)率升高。利用主成分分析將10 個指標(biāo)整合為2 個綜合指標(biāo),得到不同品種的耐熱系數(shù)和品種得分,聚類分析篩選出3 個耐高溫品種: ‘碩豐1 號’ ‘國欣9 號’和‘魯棉研28’,以及5 個不耐高溫的品種: ‘石抗126’ ‘邯無216’‘國欣4 號’ ‘滄棉268’和‘農(nóng)大601’。耐高溫能力強的品種在受到高溫脅迫后,根系表型指標(biāo)值降低的幅度較小。明確了根長、根表面積和根體積也可以作為高溫篩選的指標(biāo)。