秦積龍，魏建國(guó)，劉海平，姚小飛，林曉東，范 蕾，何 萍

黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma, MEC)是最常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤，占涎腺惡性腫瘤的30%～35%[1]，但原發(fā)肺黏液表皮樣癌(pulmonary mucoepidermoid carcinoma, PMEC)較少見(jiàn)，不足肺惡性腫瘤的1%[2]。在臨床工作中，尤其是小活檢及術(shù)中快速冷凍病理診斷中PMEC易與肺腺癌及腺鱗癌混淆。本文重點(diǎn)探討PMEC活檢、冷凍與常規(guī)切片的病理特征及MAML2基因重排情況，以提高活檢及術(shù)中快速冷凍診斷PMEC的準(zhǔn)確性，并深入分析MAML2基因重排與PMEC臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年1月～2021年4月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科存檔的51例PMEC標(biāo)本。其中手術(shù)根治標(biāo)本43例，穿刺活檢標(biāo)本8例。由兩名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，51例診斷結(jié)果一致，且患者既往無(wú)涎腺腫瘤病史，涎腺影像學(xué)檢查亦未發(fā)現(xiàn)腫瘤。收集患者的臨床病理資料包括性別、年齡、腫瘤部位、臨床表現(xiàn)、臨床分期及病理學(xué)特征，并進(jìn)行電話隨訪。

1.2 方法冷凍及常規(guī)切片行HE染色，鏡下觀察。所用一抗CKpan、TTF-1、Napsin A、CK7、CK5/6、Ventana ALK(D5F3)、EMA、CEA、p40、p63、Ki-67及S-100，均購(gòu)自福州邁新公司。免疫組化檢測(cè)均在全自動(dòng)免疫組化染色儀上進(jìn)行。黏液卡紅染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。FISH檢測(cè)MAML2基因分離情況(DNA分離探針，購(gòu)自安必平公司)。采用電話進(jìn)行隨訪。

1.3 結(jié)果判斷采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，采用Kaplan-Meier曲線和Cox單因素回歸模型進(jìn)行生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征51例PMEC中男性38例，女性13例，男女比為2.9 ∶1。年齡8～81歲，中位年齡50歲。中央型32例，年齡8～74歲，中位年齡42歲；周圍型19例，年齡36～81歲，中位年齡63歲。病變位于右上肺15例，右中肺4例，右下肺10例，左上肺10例，左下肺12例。28例行活檢，其中纖維支氣管鏡活檢20例，穿刺活檢8例。43例行肺葉切除術(shù)后均行淋巴結(jié)清掃，17例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中20例行術(shù)前活檢，23例行術(shù)中冷凍病理診斷。33例臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰(33/51)，6例伴咯血，6例伴胸痛、胸悶。18例無(wú)明顯癥狀，體檢時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)。影像學(xué)特征：中央型多位于葉或段支氣管腔內(nèi)，與支氣管關(guān)系密切，病灶大多欠均勻，低中等密度，增強(qiáng)后顯示明顯不均勻強(qiáng)化，常合并肺炎或肺不張，PET放射性攝取輕中度增高(圖1A)，擬考慮為鱗狀細(xì)胞癌或涎腺源性腫瘤：MEC。周圍型多表現(xiàn)為肺內(nèi)孤立性腫塊，腫瘤境界相對(duì)清楚，PET放射性攝取明顯增高，擬考慮為周圍型肺癌(圖1B)。臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期7例，Ⅲ期10例，Ⅳ期7例。51例患者中，單純手術(shù)治療33例，手術(shù)+化療8例，手術(shù)+靶向治療1例，手術(shù)+化療+免疫治療1例；8例經(jīng)穿刺活檢確診，未行手術(shù)治療，其中化療+免疫治療4例，單純化療1例，靶向治療1例，2例放棄治療。

圖1 A.中央型：CT示腫物位于支氣管腔內(nèi)，病灶欠均勻，低中等密度，增強(qiáng)后顯示明顯不均勻強(qiáng)化，PET放射性攝取輕中度增高；B.周圍型：CT示肺內(nèi)孤立性腫塊，腫瘤境界相對(duì)清楚，PET放射性攝取明顯增高

2.2 病理檢查

2.2.1眼觀 腫瘤最大徑0.7～8.0 cm，平均3.2 cm，無(wú)包膜，切面灰白色，有黏液感。中央型中18例位于支氣管腔內(nèi)，呈息肉樣突向管腔。周圍型腫物緊鄰胸膜，邊界清楚。

2.2.2鏡檢 28例行活檢，21例診斷為PMEC(21/28，75%)，3例診斷為肺鱗狀細(xì)胞癌(圖2)，2例診斷為肺腺癌，1例診斷為肺腺鱗癌，1例診斷為肺混合性鱗狀細(xì)胞和腺性乳頭狀瘤。23例行術(shù)中冷凍病理檢查，8例診斷為PEMC(8/23，35%)，11例診斷為腺鱗癌，3例診斷為腺癌(圖3)，1例診斷為鱗狀細(xì)胞癌。低級(jí)別PMEC鏡下見(jiàn)大小不等的囊狀及腺樣結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞異型性不明顯，未見(jiàn)明顯核分裂象及壞死，無(wú)腺癌的腺泡狀結(jié)構(gòu)及貼壁生長(zhǎng)方式，而表皮樣細(xì)胞未見(jiàn)角化及細(xì)胞間橋。其中2例出現(xiàn)囊性變，間質(zhì)膽固醇結(jié)晶形成，大量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)，在冷凍切片診斷時(shí)極易誤診為支氣管擴(kuò)張癥或間質(zhì)性肺炎。高級(jí)別PMEC鏡下見(jiàn)腫瘤組織呈實(shí)性片狀及島狀排列，很少出現(xiàn)囊狀結(jié)構(gòu)，由不典型多角形表皮樣細(xì)胞及中間細(xì)胞構(gòu)成，可見(jiàn)壞死，間質(zhì)淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)。其中3例腫瘤呈實(shí)性巢、團(tuán)狀排列，核空泡狀，核仁明顯，間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)，在冷凍切片診斷時(shí)極易誤診為淋巴上皮癌。在常規(guī)石蠟切片中間質(zhì)出現(xiàn)纖維化及硬化，8例伴鈣化，6例伴黏液變性，40例(40/51，78.4%)間質(zhì)見(jiàn)大量淋巴漿細(xì)胞浸潤(rùn)，形成腫瘤相關(guān)淋巴增生(tumour associated lymphoid proliferation, TALP)，其中23例發(fā)生在低級(jí)別，17例發(fā)生在高級(jí)別，3例伴有淋巴濾泡形成。經(jīng)廣泛取材在高級(jí)別PMEC實(shí)性片狀腫瘤周邊可見(jiàn)低級(jí)別PMEC的囊狀及腺樣結(jié)構(gòu)。病理學(xué)分級(jí)：26例(26/51，51%)為低級(jí)別，25例(25/51，49%)為高級(jí)別。中央型組以低級(jí)別為主，周圍型組以高級(jí)別為主。17例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例，病理學(xué)級(jí)別均為高級(jí)別。

圖2 纖維支氣管鏡活檢見(jiàn)腫瘤細(xì)胞呈實(shí)性巢團(tuán)狀排列 圖3 冷凍切片鏡下見(jiàn)腫瘤細(xì)胞呈腺樣排列，細(xì)胞有異型性 圖4 低級(jí)別肺黏液表皮樣癌：囊狀擴(kuò)張的腫瘤間質(zhì)見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，膽固醇結(jié)晶形成 圖5 高級(jí)別肺黏液表皮樣癌：瘤細(xì)胞呈實(shí)性片狀生長(zhǎng)，核空泡狀，可見(jiàn)明顯核仁，間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn) 圖6 腫瘤細(xì)胞彌漫表達(dá)Ventana ALK(D5F3)，Mutimer法 圖7 FISH檢測(cè)MAML2分離探針示紅綠信號(hào)分離

2.3 免疫表型及特殊染色所有腫瘤細(xì)胞包括黏液細(xì)胞、表皮樣細(xì)胞及中間細(xì)胞均彌漫表達(dá)CKpan、CK7，表皮樣細(xì)胞及中間細(xì)胞表達(dá)p40、p63及CK5/6。黏液細(xì)胞表達(dá)CK7、CEA、EMA，不表達(dá)TTF-1、Napsin A及S-100。其中1例腫瘤細(xì)胞彌漫表達(dá)ALK(圖6)，二代測(cè)序顯示EML4-ALK基因融合。低級(jí)別PMEC的Ki-67增殖指數(shù)低于10%，高級(jí)別PMEC的Ki-67增殖指數(shù)40%～90%。特殊染色黏液卡紅示黏液細(xì)胞腔內(nèi)黏液樣物陽(yáng)性。

2.4 FISH檢測(cè)PMEC中35例(35/51)MAML2基因重排陽(yáng)性(圖7)，總陽(yáng)性率為68.6%，16例MAML2基因重排陰性。MAML2基因重排陽(yáng)性的患者更常見(jiàn)于病理學(xué)分級(jí)為低級(jí)別[低級(jí)別84.6%(22/26)vs高級(jí)別52.0%(13/25)]、臨床分期早的PMEC[Ⅰ～Ⅱ期85.2%(29/34)vsⅢ～Ⅳ期35.2%(6/17)]及淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移的PMEC[無(wú)轉(zhuǎn)移88.2%(30/34)vs有轉(zhuǎn)移29.4%(5/17)](P<0.05)。MAML2基因重排與患者性別、年齡、病變部位及腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 MAML2基因重排與原發(fā)肺黏液表皮樣癌臨床病理特征的關(guān)系

2.5 隨訪本組51例PMEC患者有5例失訪，46例獲得隨訪，隨訪時(shí)間4～42個(gè)月，平均隨訪時(shí)間19個(gè)月。4例患者死亡(7～12個(gè)月)，臨床分期均為Ⅲ～Ⅳ期，均發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，2例行單純手術(shù)治療，1例行化療+免疫治療，1例行單純化療。死亡病例MAML2基因重排檢測(cè)均陰性；2例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)病例MAML2基因重排檢測(cè)均陰性；12例帶瘤生存；28例無(wú)瘤生存，無(wú)瘤生存患者M(jìn)AML2基因重排檢測(cè)均陽(yáng)性。1例ALK基因融合陽(yáng)性患者，MAML2重排陰性，伴有淋巴結(jié)及肝、腦轉(zhuǎn)移，經(jīng)手術(shù)根治及靶向藥物ALK抑制劑克唑替尼治療，隨訪18個(gè)月患者狀況良好。

2.6 生存分析單因素分析顯示患者總生存期延長(zhǎng)與臨床分期早(P=0.000 7，圖8A)、病理學(xué)分級(jí)為低級(jí)別(P=0.025 4，圖8B)、MAML2基因重排陽(yáng)性(P=0.001 9，圖8C)及手術(shù)+輔助治療/全身治療(P=0.025 4)(圖8D)均相關(guān)(P均<0.05)，而與患者年齡、部位、腫瘤體積大小均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

圖8 Kaplan-Meier曲線分析預(yù)后相關(guān)因素：A.臨床分期與患者預(yù)后的關(guān)系；B.病理學(xué)分級(jí)與患者預(yù)后的關(guān)系；C.MAML2基因重排與患者預(yù)后的關(guān)系；D.治療方式與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

PMEC是肺原發(fā)涎腺型腫瘤中最常見(jiàn)的病理類型。診斷PMEC之前首先要排除涎腺M(fèi)EC肺轉(zhuǎn)移，主要依靠臨床無(wú)涎腺腫瘤病史，涎腺影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤。PMEC發(fā)病年齡較廣泛，研究顯示無(wú)明顯性別差異[3-4]。臨床癥狀無(wú)特異性，主要表現(xiàn)為咳嗽、咳痰伴胸痛、胸悶，部分患者無(wú)明顯癥狀，因健康體檢時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，與本組情況基本相符。

術(shù)前活檢因取材量少且表淺，明確診斷常有挑戰(zhàn)性。這也是本組28例活檢病例中，7例診斷為其它腫瘤類型的原因。術(shù)中冷凍診斷是常用的檢查手段。對(duì)于PMEC的冷凍診斷，需要病理醫(yī)師充分了解PMEC的臨床病理特點(diǎn)，才能做出明確診斷。若病變不典型，醫(yī)師又缺乏對(duì)PMEC的認(rèn)識(shí)，易誤診或存在診斷上的困惑。本組23例行術(shù)中冷凍病理檢查，8例診斷為PEMC，15例診斷為其它類型肺惡性腫瘤。作者分析冷凍切片誤診的主要原因有以下三點(diǎn)：(1)病理醫(yī)師只關(guān)注切片的鏡下形態(tài)學(xué)特征，忽略了患者的臨床影像學(xué)特征，對(duì)于年齡小于40歲，特別是位于氣管或支氣管等大氣道部位的肺腫瘤患者，對(duì)于組織形態(tài)并非典型的鱗狀細(xì)胞癌或腺癌患者，病理醫(yī)師一定考慮到肺涎腺腫瘤的可能性。(2)PMEC形態(tài)復(fù)雜多樣，回顧23例冷凍病理切片的形態(tài)學(xué)特征，其中21例腫瘤呈實(shí)性片狀生長(zhǎng)，周邊出現(xiàn)腺樣及囊狀結(jié)構(gòu)，瘤細(xì)胞核深染，異型性明顯，部分可見(jiàn)壞死。(3)冷凍切片較厚，組織結(jié)構(gòu)易扭曲、變形，細(xì)胞出現(xiàn)異常增大或變小，HE染色沒(méi)有常規(guī)病理切片清晰，且通常因取材受限，存在取材不充分，有時(shí)未取到典型病變，給冷凍病理診斷帶來(lái)一定的困難；再者診斷醫(yī)師對(duì)PEMC認(rèn)識(shí)不足，鏡下發(fā)現(xiàn)腺樣結(jié)構(gòu)就首先考慮肺腺癌。需要強(qiáng)調(diào)的是：低級(jí)別PMEC與支氣管關(guān)系密切，三種成分混雜，異型性??；而支持高級(jí)別的線索包括：有低級(jí)別向高級(jí)別過(guò)渡的區(qū)域、無(wú)原位鱗狀細(xì)胞癌或原位腺癌的區(qū)域、無(wú)乳頭狀生長(zhǎng)模式、無(wú)單個(gè)細(xì)胞角化或角化株形成等?？傊顧z或冷凍病理診斷由于取材受限且無(wú)免疫組化的輔助，故應(yīng)仔細(xì)尋找PMEC的典型病理學(xué)模式。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]低級(jí)別PMEC占73%～80%，高級(jí)別占19%～26%。本組中低級(jí)別26例(26/51，51%)，高級(jí)別25例(25/51，49%)，與文獻(xiàn)報(bào)道的以低級(jí)別為主略不一致，可能與樣本的選擇偏倚有關(guān)。中央型PMEC以低級(jí)別為主，周圍型以高級(jí)別為主。Yousem等[5]報(bào)道的45例低級(jí)別PMEC中16例(16/45，36%)出現(xiàn)TALP。Shilo等[6]報(bào)道的44例低級(jí)別PMEC中6例(6/44，13.6%)出現(xiàn)TALP，6例均顯示較多且彌漫的淋巴漿細(xì)胞浸潤(rùn)，涉及至少60%的腫瘤并將其分成上皮島，認(rèn)為識(shí)別這種組織學(xué)變異對(duì)PMEC的診斷非常重要。本組40例(40/51，78.4%)腫瘤間質(zhì)出現(xiàn)TALP，其中23例發(fā)生在低級(jí)別，17例發(fā)生在高級(jí)別，3例伴有淋巴濾泡形成。當(dāng)TALP非常明顯且浸潤(rùn)上皮時(shí)，易誤診為肺黏膜相關(guān)淋巴組織結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了出現(xiàn)TALP是PMEC重要的診斷線索。

本組1例69歲女性患者，腫瘤細(xì)胞彌漫表達(dá)ALK，二代測(cè)序顯示EML4-ALK基因融合，臨床分期為Ⅳ期，伴有淋巴結(jié)及肝、腦轉(zhuǎn)移，經(jīng)手術(shù)根治后及靶向藥物ALK抑制劑克唑替尼治療，取得了較好的療效，隨訪18個(gè)月患者狀況良好。Onodera等[7]報(bào)道1例35歲女性PMEC患者，臨床分期為Ⅲ期，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)EML4-ALK基因融合，術(shù)后放化療聯(lián)合ALK抑制劑艾樂(lè)替尼治療取得了較好的療效。本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，即ALK陽(yáng)性PMEC經(jīng)ALK抑制劑靶向治療后取得較好療效。

大多數(shù)MEC中存在t(11；19)(q21；p13)染色體易位，產(chǎn)生CRTC1(CREB regulated transcription coactivator 1)-MAML2(Master mind-like gene 2)基因融合[8]。約5%的MEC存在t(11; 15)(q21; q26)易位導(dǎo)致CRTC3-MAML2基因融合[9]。MAML2重排可作為確診MEC非常實(shí)用的分子標(biāo)志物[10-11]。Achcar等[12]的研究結(jié)果顯示PMEC中MAML2重排陽(yáng)性率為77%，張欣等[13]報(bào)道MAML2重排陽(yáng)性率為80.4%(低級(jí)別組為91.7%，高級(jí)別組為40%)。本組中，MAML2重排總陽(yáng)性率為68.6%(低級(jí)別組為84.6%，高級(jí)別組為52.0%)，高級(jí)別PMEC中MAML2重排陽(yáng)性率顯著低于低級(jí)別，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Miyabe等[14]的研究結(jié)果證實(shí)MAML2重排與惰性的生物學(xué)行為及良好預(yù)后相關(guān)，且MAML2重排與較低的淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。本組資料顯示，MAML2基因重排陽(yáng)性更常見(jiàn)于病理學(xué)為低級(jí)別、臨床分期早(Ⅰ～Ⅱ期)及淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移的患者。本組中，5例死亡病例及2例復(fù)發(fā)病例病理學(xué)分級(jí)均為高級(jí)別，均發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且MAML2基因重排陰性。28例無(wú)瘤生存病例MAML2重排均陽(yáng)性。故進(jìn)一步證實(shí)了MAML2重排為預(yù)后好的指標(biāo)。研究表明MAML2重排可預(yù)測(cè)無(wú)瘤生存和疾病特異性生存，MAML2重排與更長(zhǎng)的生存期顯著相關(guān)。張欣等[13]對(duì)43例原發(fā)性PMEC患者進(jìn)行生存分析，顯示發(fā)病年齡≤40歲、腫瘤體積小、病理學(xué)分級(jí)為低級(jí)別、臨床分期早、有MAML2基因重排、確診時(shí)腫瘤無(wú)轉(zhuǎn)移及手術(shù)治療均與患者總生存期延長(zhǎng)顯著相關(guān)。本組單因素分析顯示，PMEC患者總生存期延長(zhǎng)與臨床分期早、病理學(xué)分級(jí)為低級(jí)別、MAML2重排陽(yáng)性及手術(shù)+輔助治療均相關(guān)。因此可見(jiàn)，臨床分期晚、病理學(xué)分級(jí)為高級(jí)別的PMEC預(yù)后較差，手術(shù)+輔助治療可顯著延長(zhǎng)生存期。目前PMEC尚無(wú)統(tǒng)一的治療標(biāo)準(zhǔn)，早發(fā)現(xiàn)、早診斷，并積極給予手術(shù)切除+淋巴結(jié)清掃，對(duì)患者的長(zhǎng)期預(yù)后有積極作用。本組中8例經(jīng)穿刺確診，因患者拒絕手術(shù)，未行手術(shù)治療，其中2例死亡，2例復(fù)發(fā)，1例帶瘤生存，3例失訪。

綜上所述，PMEC的活檢及術(shù)中冷凍切片診斷困難，常誤診為肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌或肺腺鱗癌，TALP對(duì)PMEC的診斷具有重要提示作用。MAML2基因重排與低級(jí)別、臨床分期早及淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示是預(yù)后好的指標(biāo)?；颊叩念A(yù)后好的因素包括臨床分期早、病理學(xué)分級(jí)為低級(jí)別、MAML2基因重排陽(yáng)性及手術(shù)+輔助治療/全身治療。