姚 勤，王晶晶，李 騫，王思捷，黃 樺，柳汝明，張 峻

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科，昆明650032)

妊娠期抑郁為妊娠期較常見的精神疾病，可危害母嬰健康，影響胎兒早期腦發(fā)育，造成子代永久性內(nèi)分泌和神經(jīng)功能受損[1-2]。心理治療效果不佳的重度抑郁患者應(yīng)采取藥物治療。選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)以安全性方面的優(yōu)勢，已占據(jù)抑郁癥治療的主導(dǎo)地位，對于缺乏用藥經(jīng)驗(yàn)的妊娠期抑郁患者，指南推薦SSRI作為一線用藥[3-4]。其中，艾司西酞普蘭對5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體選擇性最強(qiáng)，不良反應(yīng)較少，得到了較廣泛的應(yīng)用[5]。但目前關(guān)于妊娠期艾司西酞普蘭安全性的研究有限且存在爭議，可獲得的安全性資料較少[6]。本研究采用人胎盤體外循環(huán)灌注模型，研究在母體側(cè)有效劑量下，子體側(cè)的直接藥物暴露量以及藥物的胎盤透過率，為臨床提供直接、可靠的妊娠期用藥安全性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 胎盤

胎盤均來源于我院產(chǎn)科臨產(chǎn)室剖宮產(chǎn)或自然陰道分娩的健康足月(37～41周)胎盤。本研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且胎盤均為產(chǎn)婦簽字同意交醫(yī)院處理。胎盤娩出后立即浸于含肝素的0.9%氯化鈉溶液中，10 min內(nèi)運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，30 min內(nèi)建立循環(huán)。

1.2 儀器

XPE105型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；SB3222型超聲儀[必能信(上海)超聲有限公司]；Simplicity純水儀(美國Millipore公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；蠕動(dòng)泵(美國Cole-Parmer公司)；磁力攪拌器、HH-6型恒溫水浴鍋均購自常州國華電器有限公司；密閉式靜脈留置針(20 G×1.16″，批號(hào)：1322498)、動(dòng)脈采血器(批號(hào)：1284336)和一次性血?dú)夥治鲠?批號(hào)：5331863)均購自美國BD公司。

1.3 藥品與試劑

艾司西酞普蘭對照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>99.9%，批號(hào)：00710AS)；安替比林對照品(瑞士Adamas Reagent公司，純度>99.9%，批號(hào)：100506-200301)；0.9%氯化鈉注射液(上海百特有限責(zé)任公司，批號(hào)：S1709062)；Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer(邁晨科技有限公司，批號(hào)：l1801060)；5%碳酸氫鈉注射液(遂成藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H41021050，批號(hào)：11807201)；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020657，批號(hào)：F7032124)；肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32020612，批號(hào)：51809105)；小牛血清蛋白干粉(美國VWR Life Science公司，批號(hào)：0306C272)；低分子右旋糖酐干粉(瑞士Adamas Reagent公司，批號(hào)：P1054729)；超純水(自制，Millipore純水儀)。

1.4 胎盤體外循環(huán)的建立

本研究采用課題組前期成功建立并已獲得專利的人胎盤體外循環(huán)灌注模型[7-8]，在母體側(cè)選擇一塊完好的小葉，在對應(yīng)的子體側(cè)選擇一對相互伴行的動(dòng)脈、靜脈血管進(jìn)行穿刺插管，結(jié)扎動(dòng)脈上下兩端的多余分支，建立單個(gè)胎盤小葉子體側(cè)循環(huán)。灌入灌流液后若無液體滲出且動(dòng)靜脈流速一致，則將胎盤母體側(cè)向上放入托盤內(nèi)，置于37 ℃恒溫水浴中，將一端連接有導(dǎo)管的兩根鈍頭針插入灌流小葉母體絨毛膜間隙2～3 mm，建立母體側(cè)循環(huán)。通過蠕動(dòng)泵，分別向母體側(cè)和子體側(cè)泵入灌流液，建立胎盤小葉母體側(cè)和子體側(cè)閉合循環(huán)，如圖1—2。

圖1 子體側(cè)單個(gè)胎盤小葉單向循環(huán)灌注模型示意圖Fig 1 Schematic diagram of unidirectional circulation perfusion model of a single placental cotyledon of the fetal

1.磁力加熱攪拌器；2.母體側(cè)灌流池；3.子體側(cè)灌流池；4.蠕動(dòng)泵；5.胎盤艙；6.灌注胎盤小葉；7.恒溫水浴槽；8.母體動(dòng)脈；9.母體靜脈；10.子體動(dòng)脈；11.子體靜脈；血流及氣流方向如箭頭所示1. magnetic heated stirrer; 2. maternal perfusion pool; 3. fetal perfusion pool; 4. peristaltic pump; 5. placenta capsule; 6. perfusion of placental cotyledon; 7. homothermal water-bathing; 8. maternal arterial; 9. maternal venous; 10. fetal arterial; 11. fetal venous; the arrow represents the direction of blood flow and airflow圖2 單個(gè)胎盤小葉雙向循環(huán)灌注模型Fig 2 Schematic diagram of bidirection circulating perfusion model of a single placenta cotyledon

整個(gè)實(shí)驗(yàn)均在37 ℃條件下完成。胎盤灌流液為Krebs-Ringer緩沖液[含葡萄糖(Glu)1.8 g/L，氯化鉀0.34 g/L，氯化鎂0.046 8 g/L，氯化鈉7.0 g/L，磷酸二氫鈉0.18 g/L，磷酸氫二鈉0.1 g/L]加入肝素鈉注射液25 IU/mL、注射用青霉素鈉1 600 IU/mL、小牛血清蛋白30 g/L、右旋糖酐8.4 g/L(母體池)和右旋糖酐30 g/L(子體池)，再加入適量碳酸氫鈉注射液調(diào)節(jié)pH至7.20～7.40[7,9]，充分?jǐn)嚢枞芙狻９嗔鏖_始前，子體池通入95%N2/CO2模擬子宮內(nèi)低氧環(huán)境，母體池通入95%O2/CO2保證母體側(cè)氧含量。蠕動(dòng)泵速度為子體側(cè)3 mL/min，母體側(cè)12 mL/min。

正式灌注前先進(jìn)行30 min預(yù)灌注，清除動(dòng)脈、靜脈血管內(nèi)殘留的血液，使溫度、氣體分壓和灌流液流速等達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。預(yù)灌注結(jié)束后，換用新鮮的Krebs-Ringer緩沖液，在母體池加入的艾司西酞普蘭和陽性對照物安替比林標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得艾司西酞普蘭和安替比林的濃度分別為100 ng/mL和100 μg/mL。持續(xù)灌注3 h，于0、10、20、30、45、60、90、120、150和180 min取樣，用本實(shí)驗(yàn)室所建立的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定母體池和子體池艾司西酞普蘭和安替比林濃度。于0、30、60、90、120、150和180 min取樣，測定Glu、乳酸(Lac)、β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、pH和氧分壓(PO2)水平。

1.5 人胎盤體外循環(huán)灌注模型評(píng)價(jià)指標(biāo)

以下條件均滿足，則人胎盤體外循環(huán)灌注模型建立成功。

1.5.1 溫度：實(shí)驗(yàn)過程中，為模擬人體子宮內(nèi)的正常溫度，放置胎盤的水浴槽以及母體池和子體池中灌流液的溫度均需維持在36.5～37.5 ℃。

1.5.2 子體側(cè)滲漏量：滲漏量是模型建立是否成功的最直觀表現(xiàn)形式。循環(huán)灌注過程中，胎盤結(jié)構(gòu)損傷及循環(huán)灌注壓力可能導(dǎo)致子體側(cè)灌流液滲出，蓄積在胎盤血管或組織內(nèi)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。但由于灌流液需持續(xù)加熱、通入氣體，也會(huì)存在一定量的液體蒸發(fā)，因此，該模型實(shí)驗(yàn)過程中允許但限制子體池中有少量液體損失。循環(huán)結(jié)束時(shí)量取子體池中灌流液體積，子體側(cè)滲漏率≤4 mL/h[10]，3 h滲漏量應(yīng)<12 mL。

1.5.3 pH、PO2：人體內(nèi)酸堿平衡是維持機(jī)體進(jìn)行正常生理活動(dòng)的重要條件之一。實(shí)驗(yàn)過程中，子體池和母體池灌流液pH需維持在7.20～7.40，以保證胎盤組織的正常代謝功能[7,9]。O2是維持胎兒生命最重要的物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)過程中，為維持胎盤小葉活性，子體池灌流液PO2應(yīng)維持在75～112.5 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，母體池灌流液PO2應(yīng)維持在187.5～262.5 mm Hg[9,11]。

1.5.4 Glu、Lac檢測：機(jī)體代謝過程中的呼吸作用會(huì)消耗Glu，同時(shí)代謝產(chǎn)生Lac。母體側(cè)循環(huán)與子體側(cè)循環(huán)持續(xù)有Glu消耗及Lac生成，且Glu消耗量(ΔGlu)與Lac生成量(ΔLac)無較大波動(dòng)，表明被灌注小葉組織活性正常，即ΔGlu>0，ΔLac>0(ΔLac=Cb-Ca，ΔGlu=Ca-Cb，Ca表示前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)含量測定結(jié)果，Cb表示后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)含量測定結(jié)果)。

1.5.5 β-hCG生成量(Δβ-hCG)：β-hCG是人絨毛膜促性腺激素的β亞單位，是由胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白。正?；钚缘娜颂ケP能夠持續(xù)分泌β-hCG，即母體池胎盤灌流液中Δβ-hCG>0(Δβ-hCG=Cb-Ca)。

1.5.6 安替比林透過率：安替比林是人類胎盤體外循環(huán)灌注模型中常用陽性標(biāo)記物。安替比林可通過被動(dòng)擴(kuò)散的方式透過胎盤屏障進(jìn)入胎兒循環(huán)，且其胎盤透過率不受灌流液中蛋白含量以及灌流液中其他藥物的影響，因此，其透過率也是評(píng)判胎盤體外循環(huán)灌注模型中胎盤活性的標(biāo)準(zhǔn)之一。一般要求當(dāng)安替比林經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到平衡后，安替比林胎盤透過率>20%[9,12]。

1.6 艾司西酞普蘭胎盤透過率

藥物胎盤透過率計(jì)算公式為，透過率=CF(180 min)/CM(0 min)，即子體池最終藥物濃度與母體池初始濃度之比。

1.7 灌流液中安替比林及艾司西酞普蘭濃度檢測

使用課題組建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定灌流液中安替比林及艾司西酞普蘭的濃度，詳見文獻(xiàn)[13-14]。

2 結(jié)果

本研究共進(jìn)行了158例人類胎盤體外循環(huán)灌注模型的建立，符合模型建立成功所有評(píng)價(jià)指標(biāo)的共15例。

2.1 人胎盤體外循環(huán)灌注模型成功建立的評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)果

2.1.1 溫度：本研究建立成功的15例艾司西酞普蘭人類胎盤體外循環(huán)灌注模型中，在3 h的雙向循環(huán)灌注過程中，水浴槽內(nèi)、子體池與母體池內(nèi)胎盤灌流液的溫度均維持在36.5～37.5 ℃的正常范圍內(nèi)，能夠模擬人體子宮內(nèi)的正常溫度，符合循環(huán)建立成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.1.2 子體側(cè)滲漏量：本研究成功建立的15例艾司西酞普蘭人胎盤體外循環(huán)灌注模型中，在3 h的雙向循環(huán)灌注過程中子體側(cè)漏液量<12 mL，漏液率均<4 mL/h，符合循環(huán)建立成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.1.3 pH、PO2：本研究成功建立的15例艾司西酞普蘭人胎盤體外循環(huán)灌注模型中，3 h循環(huán)灌注過程子體池和母體池pH、PO2見表1。兩池胎盤灌流液中pH均維持在7.20～7.40；子體池與母體池PO2均符合要求。

表1 艾司西酞普蘭胎盤透過性實(shí)驗(yàn)中pH、PO2結(jié)果Tab 1 pH and pO2 in the placental permeability test of

2.1.4 ΔGlu、ΔLac及Δβ-hCG：本研究成功建立的15例艾司西酞普蘭人胎盤體外循環(huán)灌注模型中，子體池與母體池的ΔGlu、ΔLac、母體池的Δβ-hCG見表2。3 h循環(huán)灌注過程中，ΔGlu和ΔLac均>0，母體側(cè)Δβ-hCG>0，提示整個(gè)循環(huán)灌注過程中胎盤組織始終保持活性。

表2 艾司西酞普蘭胎盤透過性實(shí)驗(yàn)中ΔGlu、ΔLac及Tab 2 Consumption of ΔGlu，ΔLac and Δβ-hCG in the placental permeability test of escitalopram n=15)

2.1.5 安替比林胎盤透過率：本研究成功建立的15例人胎盤體外循環(huán)灌注模型中，安替比林經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)平衡后透過率見表3。安替比林經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的透過率-時(shí)間圖見圖3。當(dāng)循環(huán)灌注至150～180 min時(shí)，安替比林胎盤透過率趨近平衡，循環(huán)灌注結(jié)束時(shí)，安替比林平均胎盤透過率為(38.41±6.91)%>20%，符合循環(huán)建立成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表3 胎盤透過性實(shí)驗(yàn)中安替比林的平均胎盤透過率Tab 3 Mean placental permeation rate of antipyrine in the placental permeability test n=15)

2.2 艾司西酞普蘭胎盤透過率結(jié)果

本研究共成功建立艾司西酞普蘭灌流的人胎盤體外循環(huán)灌注模型15例，3 h灌流結(jié)束后，艾司西酞普蘭的平均胎盤透過率為(9.09±2.80)%，見表4、圖3。為減少因胎盤小葉厚度、大小等不同產(chǎn)生的差異，同時(shí)計(jì)算了艾司西酞普蘭的相對透過率，即艾司西酞普蘭與安替比林透過率的比值，以減少誤差，見表5。

表4 艾司西酞普蘭胎盤透過性實(shí)驗(yàn)中艾司西酞普蘭的平均胎盤透過率Tab 4 Mean placental permeation rate of escitalopram in the placental permeability test of escitalopram n=15)

圖3 15例艾司西酞普蘭胎盤透過性實(shí)驗(yàn)中艾司西酞普蘭和安替比林平均胎盤透過率Fig 3 Mean placental permeation rates of escitalopram and antipyrine in the 15 cases of placental permeability test of escitalopram

表5 艾司西酞普蘭胎盤透過性實(shí)驗(yàn)中艾司西酞普蘭的相對胎盤透過率Tab 5 Relative placental permeation rate of escitalopram in the placental permeability test of escitalopram n=15)

3 討論

妊娠期使用艾司西酞普蘭的研究涉及倫理原則，可獲得的臨床數(shù)據(jù)有限。多數(shù)研究為回顧性研究，且結(jié)果差異較大。本研究首次利用人類胎盤體外循環(huán)灌注模型研究艾司西酞普蘭在我國人群中的胎盤透過性。結(jié)果表明，艾司西酞普蘭的平均胎盤透過率約為9.09%。藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的程度取決于胎盤的功能活性、臍動(dòng)靜脈血液流速、母體子宮螺旋動(dòng)脈血液流速、藥物的理化性質(zhì)、藥物的藥動(dòng)學(xué)特性以及胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白影響等。實(shí)驗(yàn)過程中，建立嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，如pH、PO2、ΔGlu、ΔLac、子體側(cè)滲漏量、母體側(cè)Δβ-hCG以及安替比林胎盤透過率均符合要求，保證胎盤維持正?；钚院凸δ?；通過查閱文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)[7,11-12]，選擇子體側(cè)3 mL/min，母體側(cè)12 mL/min的灌流速度，模擬母體子宮內(nèi)血液流速及子體內(nèi)血液流速；艾司西酞普蘭血漿蛋白結(jié)合率較高，約80%，藥物可能與血漿蛋白、胎盤小葉組織中蛋白結(jié)合，影響藥物的胎盤透過性。本實(shí)驗(yàn)灌流液中加入接近妊娠期正常生理水平的蛋白含量，但由于人體內(nèi)蛋白含量存在個(gè)體差異，可能會(huì)對本研究結(jié)果造成一定的影響。同時(shí)，藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)過程中還受轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響，目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分SSRI是外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P糖蛋白(P-gp)的底物[15-16]，并對攝入轉(zhuǎn)運(yùn)體有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體3(OCT3)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能有抑制作用[17]，P-gp能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的藥物泵回到母體側(cè)，OCT3抑制藥物從胎盤到子體側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減少妊娠期服用SSRI患者體內(nèi)藥物的胎兒暴露。尚未見針對艾司西酞普蘭在胎盤屏障中相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究。

目前，利用人類胎盤體外循環(huán)灌注模型對SSRI進(jìn)行研究的報(bào)道僅有1篇國外研究和1篇本課題組研究。Heikkine等[18]利用該模型對氟西汀和西酞普蘭進(jìn)行了灌注，結(jié)果表明，2 h灌注結(jié)束后，氟西汀和西酞普蘭透過率分別為8.7%和9.1%。其透過率計(jì)算方法與本研究不同，若本研究采用Heikkine等研究中的透過率計(jì)算方法，15例艾司西酞普蘭平均胎盤透過率為4.45%。不同胎盤小葉之間存在大小、絨毛層厚度、血管壁厚度等差異，會(huì)造成胎盤透過率的差異。本課題組采用與本研究相同方法研究了氟西汀、去加氟西汀和舍曲林的胎盤透過性，其透過率分別為8.74%、10.7%和5.9%[19]。與本研究結(jié)果相比較，舍曲林的胎盤透過率相對較低，提示胎兒的藥物暴露及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)相對較小。

此外，本研究使用的胎盤均為足月胎盤，結(jié)果僅能代表艾司西酞普蘭在足月胎盤屏障中的轉(zhuǎn)移，不能代表整個(gè)妊娠期，這也是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要局限性。

綜上所述，艾司西酞普蘭可透過胎盤，妊娠期間母親服用艾司西酞普蘭可能會(huì)使胎兒暴露于低濃度藥物中。臨床在使用艾司西酞普蘭的妊娠期抑郁女性，應(yīng)根據(jù)抑郁的嚴(yán)重程度和藥物治療史，衡量是否使用艾司西酞普蘭進(jìn)行治療，并應(yīng)經(jīng)患者知情同意，確保患者理解使用和不使用藥物治療的風(fēng)險(xiǎn)及替代的選擇方案。