葉浩然，郭玉紅，何莎莎，杜 元，王宇琛

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院急診科，北京 100010； 2.北京市中醫(yī)藥研究所，北京 100010； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

失血性休克是由于出血引起的有效循環(huán)血容量減少、組織器官灌注不足，以組織缺氧、細(xì)胞代謝紊亂和器官功能受損為主要改變的病理過(guò)程[1]。由于血液廣布全身，失血性休克損傷范圍也具有多系統(tǒng)、多器官、多靶點(diǎn)的病理特點(diǎn)。在微觀層面上，組織細(xì)胞缺血缺氧并開始無(wú)氧代謝，這個(gè)過(guò)程中會(huì)累積大量乳酸、磷酸鹽以及氧自由基，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。不同時(shí)期對(duì)失血性休克的治療也反映了當(dāng)時(shí)人們對(duì)其病理生理過(guò)程的認(rèn)識(shí)水平。大量補(bǔ)液、擴(kuò)充血容量是治療休克的關(guān)鍵，但是復(fù)蘇所致的缺血再灌注損傷也不容忽視，可能與自由基、鈣超載和炎癥激活相關(guān)[3-5]。

參附注射液是依據(jù)宋代《校注婦人良方》中記載的 “參附湯”結(jié)合現(xiàn)代制藥方法研制而成，主要成分為紅參和黑附片，具有回陽(yáng)救逆、益氣固脫之效。動(dòng)物研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參附注射液可以改善休克大鼠血流動(dòng)力學(xué)，維持重要臟器的灌注，并通過(guò)降低炎癥因子水平、減少氧化應(yīng)激及抑制鈣超載等方式減少IRI[5-8]。中藥成分復(fù)雜、靶點(diǎn)眾多，導(dǎo)致有關(guān)中藥機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究選擇眾多，造成實(shí)驗(yàn)人員“無(wú)從下手”的局面，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性和系統(tǒng)性特點(diǎn)恰好符合中醫(yī)的整體觀念，從理論層面將生物學(xué)與藥理學(xué)結(jié)合，通過(guò)藥物網(wǎng)絡(luò)和生物網(wǎng)絡(luò)之間的相互關(guān)系尋找藥物可能的作用機(jī)制[9]。目前，有關(guān)參附注射液的研究較多，但是其治療失血性休克作用機(jī)制方面仍存在研究空白。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)估參附注射液作用靶點(diǎn)，并通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)、基因本體(GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析及分子對(duì)接等多種分析手段探究其治療失血性休克的主要活性成分、重要靶點(diǎn)和可能存在的通路機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 參附注射液有效成分及作用靶點(diǎn)篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，https://www.tcmspw.com)[10]檢索參附注射液主要組成中藥的化學(xué)成分，再根據(jù)藥物吸收、分布、代謝及排泄過(guò)程特性進(jìn)行潛在活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選。以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為條件進(jìn)行篩選[11]；將篩選后的結(jié)果在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中查找對(duì)應(yīng)基因。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選

以“Hemorrhagic shock”為檢索詞，通過(guò)GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)檢索人類失血性休克相關(guān)靶點(diǎn)，并用相同檢索詞檢索人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM，https://omim.org/)、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)中的相關(guān)靶點(diǎn)作為補(bǔ)充，最終建立失血性休克相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)交集

利用R語(yǔ)言對(duì)參附注射液靶點(diǎn)和失血性休克靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

為了研究藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)之間的相互作用，將交集靶點(diǎn)通過(guò)STRING平臺(tái)構(gòu)建PPI圖。相關(guān)參數(shù)如下：基因物種設(shè)為“Homo sapiens”，蛋白相互關(guān)系為0.4，其余為默認(rèn)設(shè)置。將結(jié)果用Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行可視化，得到參附注射液關(guān)于失血性休克的PPI圖。

1.5 藥物-有效成分-基因靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將參附注射液治療失血性休克的成分及相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建參附注射液-有效成分-基因靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)圖以節(jié)點(diǎn)和邊的方式描述成分之間的關(guān)系，初步研究參附注射液治療失血性休克可能的藥理作用和機(jī)制[12]。使用Cytoscape內(nèi)嵌的cytoHubba-Degree程序?qū)W(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，得到不同節(jié)點(diǎn)的度值(Degree)，依據(jù)Degree調(diào)節(jié)靶點(diǎn)顏色，Degree越大則顏色越紅。

1.6 富集分析

通過(guò)R語(yǔ)言clusterProfiler包進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，明確參附注射液和失血性休克相關(guān)靶點(diǎn)功能[13]。設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)P<0.05，根據(jù)P值由小到大排序，選取GO富集分析生物學(xué)過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)各過(guò)程前10個(gè)，以及KEGG前20條通路繪制圈圖。

1.7 分子對(duì)接

基于Degree分別選取排序居前4位的藥物成分和排序居前4位的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。從Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.pdbus.org/)和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得成分、靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)。使用Pymol 2.4.0先對(duì)受體大蛋白進(jìn)行預(yù)處理，包括去除水分子、鹽離子及配體，然后使用AutoDock Tools 1.5.7對(duì)Pymol處理后的大分子受體進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷數(shù)。小分子配體通過(guò)AutoDock Tools 1.5.7 的Torsion Tree功能進(jìn)行處理。再調(diào)整對(duì)接盒子位置和大小，使其能夠完全覆蓋大分子。最后運(yùn)行對(duì)接盒子，使用Docking內(nèi)Local Search Parameters算法進(jìn)行對(duì)接，用autodock運(yùn)行對(duì)接后結(jié)果，通過(guò)對(duì)結(jié)果分析，選取對(duì)接能量最穩(wěn)定的形式用Pymol作圖，并標(biāo)出相應(yīng)對(duì)接位點(diǎn)以及結(jié)合氫鍵。分子對(duì)接結(jié)合能表示受體配體結(jié)合所需能量，結(jié)合能>0 kJ/mol表示結(jié)合過(guò)程所需要的能量，結(jié)合能<0 kJ/mol表示結(jié)合過(guò)程所釋放的能量；一般而言，結(jié)合能<0 kJ/mol的受體配體存在自發(fā)結(jié)合的可能，具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 藥物-疾病靶點(diǎn)

參附注射液主要成分為紅參、黑附片提取物，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索紅參、附子，初步檢索得到紅參化學(xué)成分74種，附子65種。設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18后，得到紅參主要有效成分4種，附子21種，將參附注射液主要有效成分結(jié)果在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中查找對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因。以“Hemorrhagic shock”為檢索詞，對(duì)Genecards、OMIM、TDD和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，合并數(shù)據(jù)庫(kù)后去除重復(fù)共得到4 058個(gè)不同靶點(diǎn)。失血性休克和參附注射液的交集靶點(diǎn)共30個(gè)，其韋恩圖見圖1。失血性休克與參附注射液交集靶點(diǎn)列表見表1。

圖1 失血性休克靶點(diǎn)與參附注射液靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Venn diagram of hemorrhagic shock target and Shenfu injection target

表1 失血性休克與參附注射液交集靶點(diǎn)列表Tab 1 List of intersection targets of hemorrhagic shock and Shenfu injection

2.2 參附注射液治療失血性休克的PPI圖

將30個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果顯示，PDE3A與其他靶點(diǎn)無(wú)相互作用，剩余靶點(diǎn)用Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行PPI可視化，得到交集靶點(diǎn)PPI圖；通過(guò)cytoHubba-Degree值篩選出重要靶點(diǎn)，顏色越深、點(diǎn)越大則代表靶點(diǎn)越重要，前6位重要靶點(diǎn)為腫瘤壞死因子(TNF)、胱天蛋白酶(CASP)3、白細(xì)胞介素(IL)1β、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶(PTGS)2、雌激素受體(ESR)1和CASP8，見圖2。

圖2 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 PPI network diagram of intersection target

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

根據(jù)失血性休克與參附注射液交集靶點(diǎn)列表(表1)，用Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建藥物-有效成分-基因靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，明確參附注射液中發(fā)揮治療效果的成分和靶點(diǎn)，見圖3。圖3顯示，參附注射液通過(guò)9個(gè)活性成分作用于30個(gè)失血性休克靶點(diǎn)；節(jié)點(diǎn)顏色與該節(jié)點(diǎn)Degree呈正相關(guān)，顏色越紅代表Degree越大，表示生物學(xué)重要性越強(qiáng)。

FZ為附子；FZ1為sitosterol；FZ2為11,14-eicosadienoic acid；FZ3為Delphin_qt；FZ4為 Deltoin；FZ5為Deoxyandrographolide；FZ6為Karanjin；HSh為紅參；HSh1為beta-sitosterol；HSh2為DNOP；HSh3為ginsenoside rh2；HS為失血性休克FZ is epimedium; FZ1 is sitosterol; FZ2 is 11,14-eicosadienoic acid; FZ3 is Delphin_qt; FZ4 is Deltoin; FZ5 is Deoxyandrographolide; FZ6 is Karanjin; HSh is red ginseng; HSh1 is beta-sitosterol; HSh2 is DNOP; HSh3 is ginsenoside rh2; HS is Hemorrhagic Shock圖3 藥物-有效成分-基因靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Drug-active component-gene target-disease regulatory network

2.4 富集分析

對(duì)參附注射液治療失血性休克的30個(gè)靶點(diǎn)通過(guò)R語(yǔ)言進(jìn)行GO、KEGG富集分析，見圖4。GO富集結(jié)果顯示，參附注射液治療失血性休克涉及的分子功能主要為細(xì)胞凋亡，參與對(duì)激素、脂質(zhì)和含氧化合物等生物過(guò)程，作用于細(xì)胞膜、線粒體外膜等部位。KEGG富集結(jié)果表明，參附注射液治療失血性休克主要涉及甲型流感病毒、軍團(tuán)桿菌病、乙型肝炎、人類巨細(xì)胞病毒感染和IL-17信號(hào)通路等。

2.5 分子對(duì)接

將Degree排序居前4位的化合物和排序居前4位的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，分別為HSh1 (Beta-sitosterol)、HSh3(Ginsenoside rh2)、FZ4 (Deltoin)、FZ6(Karanjin)和PTGS2、核受體輔激活蛋白(NCOA)2、PTGS1、腎上腺素受體β(ADRB)2(表2)。結(jié)果顯示，除Ginsenoside rh2和NCOA2結(jié)合能為87 864 kJ/mol外，其余均<0 kJ/mol，表明大部分受體和配體可自發(fā)結(jié)合，利用Pymol制作對(duì)接模式圖，見圖5。

表2 配體-受體結(jié)合能Tab 2 Ligand-receptor binding energy

A.GO-MF；B.GO-BP；C.GO-CC；D.KEGGA.GO-MF; B.GO-BP; C.GO-CC; D.KEGG圖4 富集分析Fig 4 Enrichment analysis

圖5 配體-受體結(jié)合位點(diǎn)圖Fig 5 Diagram of ligand-receptor binding sites

3 討論

休克屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的急危重癥，屬于中醫(yī)“厥脫證”范疇，病機(jī)主要為氣血逆亂，血行障礙，內(nèi)閉外脫，陰陽(yáng)不相承接，其演變常為由氣及血，由陰涉陽(yáng)，由厥而脫，由脫而亡。古籍中雖無(wú)失血性休克病名，但對(duì)大量失血所致臨床癥狀的描述較為豐富，《醫(yī)林繩墨·厥》記載，“有血厥者，因而吐衄過(guò)多，上竭下厥，先致足冷，有如水洗，冷過(guò)腰膝，入腹即死，此血竭而作厥也”；《景岳全書》記載，“血脫者，如大崩大吐，或產(chǎn)血盡脫，則氣亦隨之而脫，故致卒仆暴死”。厥脫以回陽(yáng)救逆、益氣固脫為治則治法，參附注射液基于古方參附湯，改變?cè)锌诜盟幏绞剑ㄟ^(guò)靜脈給藥更利于臨床危重患者的治療和管理。

通過(guò)分析參附注射液治療失血性休克的主要成分，篩選出β-谷甾醇、人參皂苷rh2和去氧穿心蓮內(nèi)酯等小分子物質(zhì)。失血性休克發(fā)展過(guò)程中，類似損傷相關(guān)的分子模式、核因子κB(NF-κB)的激活致使體內(nèi)產(chǎn)生大量炎癥因子[14-18]。研究結(jié)果顯示，β-谷甾醇可通過(guò)下調(diào)IL-6、TNF的表達(dá)，抑制NF-κB活化，以減輕炎癥反應(yīng)所帶來(lái)的損害[19-20]。去氧穿心蓮內(nèi)酯不但具有抑制NF-κB激活的抗炎作用[21]，還可以提高體內(nèi)谷胱甘肽水平、激活核因子NF-E2相關(guān)因子，防御因缺血造成的氧化應(yīng)激損傷[22-23]。心臟為了維持休克后血壓等循環(huán)系統(tǒng)的正常生理功能，會(huì)代償性搏動(dòng)增快[24]。而人參皂苷rh2可以通過(guò)抑制Na+-K+-ATP酶使胞內(nèi)Na+增多，促進(jìn)心肌細(xì)胞Na+和Ca2+交換，使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，增強(qiáng)心肌收縮力，幫助維持血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定[25]。

從PPI結(jié)果看，IL-1β和TNF均屬于促炎因子，可用于評(píng)估失血性休克治療效果。既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有效的治療可以顯著降低IL-1β和TNF水平，提示體內(nèi)炎癥得到較好控制[26]。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，IL-1β水平與失血性休克72 h內(nèi)死亡率有相關(guān)性[27]；抑制TNF、IL-1β基因的表達(dá)可以幫助維持失血性休克后平均動(dòng)脈壓[28]。從細(xì)胞凋亡途徑來(lái)看，參附注射液可通過(guò)抑制CASP3的表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用[29]。

GO功能富集分析分別從MF、BP和CC 3個(gè)角度闡述參附注射液的作用機(jī)制。GO-MF中，可見多條炎癥、凋亡相關(guān)分子功能，這一點(diǎn)與PPI中PTGS的作用具有密不可分的關(guān)系。PTGS是環(huán)氧合酶(COX)的編碼基因，COX對(duì)維持正常生理功能、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過(guò)程都有著重要作用[30]。參附注射液可通過(guò)抑制COX，減輕炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過(guò)程[31]。GO-CC描述參附注射液在細(xì)胞內(nèi)的作用部位，其中死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC)由Fas/FADD/Caspase8酶原組成，是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵途徑之一[32-33]。研究結(jié)果顯示，參附注射液可以使Fas顯著降低，干擾DISC介導(dǎo)的凋亡發(fā)生，從而減少細(xì)胞死亡[34]。KEGG分析結(jié)果中，甲型流感通路從病因?qū)W方面帶來(lái)了新的啟示，即甲型流感也可以發(fā)展成為失血性休克，其原因可能與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致胃腸道出血相關(guān)[35]。最后，分子對(duì)接過(guò)程依據(jù)氫鍵的形成確定了參附注射液有效成分與失血性休克相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合的明確可能。

總之，參附注射液治療失血性休克的成分很多，可能治療失血性休克的靶點(diǎn)也很多，但真正深入進(jìn)行的動(dòng)物研究甚至臨床研究卻不多，如對(duì)人參皂苷這樣的“明星物質(zhì)”的研究也并不是很透徹。究其原因，可能是中藥成分復(fù)雜，疾病靶點(diǎn)眾多，有時(shí)讓研究人員感覺無(wú)從下手。故本研究試圖從目前已知分子結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上，為臨床前研究提供理論研究依據(jù)，預(yù)測(cè)可能有效的機(jī)制，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)提供思路。