蘇 若，李桂女

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102； 2. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570100）

肝復(fù)康丸是由五味子、太子參、白花蛇舌草加工而成的復(fù)方丸劑，具有收斂、益氣、解毒、降低轉(zhuǎn)氨酶的功效，常用于急慢性肝炎、早期肝硬化、肝功能不良等癥［1］。《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) 中藥成方制劑（第七冊(cè)）》WS3-B-1146-92 中僅采用薄層色譜法對(duì)五味子、太子參、白花蛇舌草做了定性鑒別，以及檢查丸劑通則項(xiàng)下相關(guān)項(xiàng)目［1］。文獻(xiàn)［2 - 3］也僅對(duì)五味子單味藥材中的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等成分做了方法學(xué)研究，方法專屬性低，無(wú)法全面、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)肝復(fù)康丸的質(zhì)量。指紋圖譜以高效液相色譜（HPLC）法為分析手段，與指標(biāo)成分定量分析相結(jié)合，用于評(píng)價(jià)中藥制劑質(zhì)量的整體性和穩(wěn)定性［4］。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）法是通過(guò)主成分分析（PCA）結(jié)合統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)現(xiàn)分類和篩選差異標(biāo)志物的目的［5］。中藥指紋圖譜結(jié)合 PLS - DA 和PCA 等化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)具有直觀性及預(yù)測(cè)性等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量的控制和評(píng)價(jià)［6-7］。本研究中采用HPLC 法建立了肝復(fù)康丸的指紋圖譜，并指認(rèn)出其中11種成分，同時(shí)結(jié)合PLS- DA 分析了4 個(gè)生產(chǎn)廠家的16 批樣品，為肝復(fù)康丸的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；XS525型電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)，精度為0.01 mg）；KQ-500DBG型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為450 W，頻率為40 kHz）；QYSW-30A型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)為110957-202025，含量為99.5%），五味子酯甲對(duì)照品（批號(hào)為111549 -202006，含量為95.9%），五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)為110763 - 202115，含量為99.1%），五味子乙素對(duì)照品（批號(hào)為110767-202013，含量為99.6%），槲皮素對(duì)照品（批號(hào)為100181-202110，含量為99.5%），山柰素對(duì)照品（批號(hào)為110861 - 202117，含量為95.2%），4 - 香豆酸對(duì)照品（批號(hào)為112057-202009，含量為99.3%），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為110783 - 202111，含量為98.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；太子參環(huán)肽B對(duì)照品（批號(hào)為200511，含量≥98.1%），車葉草苷對(duì)照品（批號(hào)為191218，含量≥98.0%），去乙酰車葉草酸酐對(duì)照品（批號(hào)為1911018，含量≥96.8%），均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；肝復(fù)康丸為市售，其相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 肝復(fù)康丸樣品信息、生產(chǎn)廠家與規(guī)格Tab.1 Information，manufacturers and specifications of Ganfukang Pills samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［8-10］與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Ecilipse C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%醋酸溶液（B），梯度洗脫（程序見(jiàn)表2）；流速：0.95 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm（太子參環(huán)肽B），238 nm（車葉草苷和去乙酰車葉草酸酐），254 nm（五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素），320 nm（阿魏酸和4-香豆酸），369 nm（槲皮素和山柰素）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，11 個(gè)成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對(duì)稱因子為0.96～1.06，表明系統(tǒng)適用性良好。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.2 Program of gradient elution of mobile phase（%）

2.2 溶液制備

分別取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、車葉草苷、去乙酰車葉草苷酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰素、阿魏酸、4-香豆酸對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解成質(zhì)量濃度分別為182.7，236.7，218.3，200.8，240.2，366.8，147.2，198.5，201.2，421.5，202.9 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。分別取 16 批樣品，每批5 袋，研細(xì)，混勻，取2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入85%甲醇50 mL，密塞，靜置1 h，稱定質(zhì)量，室溫超聲提取（功率為450 W，頻率為40 kHz）40 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用85%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以車葉草苷（14號(hào)峰）為參照。結(jié)果26 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.14%～0.54%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.28%～0.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為A3），按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置0，5，10，15，20，24，48，72 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以車葉草苷（14號(hào)峰）為參照。結(jié)果26 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.35%～1.09%（n=8），相對(duì)峰面積的RSD為0.69%～2.37%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為A3），按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以車葉草苷（14號(hào)峰）為參照。結(jié)果26個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.77%～1.96%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為 0.91%～1.93%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜生成與共有峰確定

按2.2 項(xiàng)下方法制備16 批樣品的供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A 版分析。以A4 為參照?qǐng)D譜，獲得16 批樣品的HPLC 疊加指紋圖譜。由圖1 可知，共有峰有26個(gè)。通過(guò)與混合對(duì)照品溶液保留時(shí)間比對(duì)，共標(biāo)定11 個(gè)色譜峰，分別為去乙酰車葉草酸酐（1 號(hào)峰）、阿魏酸（5號(hào)峰）、4-香豆酸（6號(hào)峰）、槲皮素（10號(hào)峰）、山柰素（12 號(hào)峰）、車葉草苷（14 號(hào)峰）、太子參環(huán)肽B（18 號(hào)峰）、五味子醇甲（20號(hào)峰）、五味子酯甲（22號(hào)峰）、五味子甲素（23 號(hào)峰）、五味子乙素（24 號(hào)峰）。詳見(jiàn)圖2。16 批樣品的相似度分別為0.941，0.939，0.947，0.933，0.956，0.951，0.959，0.953，0.894，0.897，0.900，0.899，0.913，0.916，0.915，0.920，表明樣品質(zhì)量總體穩(wěn)定。

2.4.2 參照峰選擇及相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算

由圖1 和圖2 可知，車葉草苷（14 號(hào)峰）峰面積響應(yīng)大且與前后峰分離好，故以車葉草苷為參照。16 批樣品HPLC 疊加指紋圖譜中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.19%～1.95%，相對(duì)峰面積的RSD為1.14%～2.87%。

圖1 16批肝復(fù)康丸高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 16 batches of Ganfukang Pills

圖2 混合對(duì)照品溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.5 PLS-DA 模型建立與分析

2.5.1 PLS-DA 模型建立

為分析不同廠家樣品的差異性，將26 個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，啟動(dòng)PLS - DA 程序，獲得PLS - DA 模型［11］。提取 2 個(gè)主成分，行置換檢驗(yàn)（設(shè)置分類矩陣變量，隨機(jī)排列20 次），R2擬合直線和Q2擬合直線在Y坐標(biāo)軸的截距分別為0.573 和- 0.255，提示所建模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。詳見(jiàn)圖3。

圖3 PLS-DA模型置換檢驗(yàn)圖Fig.3 Permutation test of PLS-DA

2.5.2 PLS-DA

PLS - DA 模型中所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均在95%置信區(qū)間內(nèi)，表明4 個(gè)生產(chǎn)廠家樣品的整體質(zhì)量差異不大；同一廠家樣品緊密聚集，各批次間差距小，表明產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定（圖4）。PLS-DA 載荷散點(diǎn)圖中，距離中心離散程度越遠(yuǎn)，成分權(quán)重越大，對(duì)樣品差異性作用也越大。太子參環(huán)肽B（18 號(hào)峰）、五味子醇甲（20 號(hào)峰）、車葉草苷（14號(hào)峰）、五味子甲素（23號(hào)峰）、五味子乙素（24號(hào)峰）5 種成分距離中心離散程度較遠(yuǎn)（圖5）。10 個(gè)色譜峰的變量重要性投影大于1為差異標(biāo)志物，其中太子參環(huán)肽B、五味子醇甲、車葉草苷、五味子甲素及五味子乙素5 個(gè)已知化合物對(duì)結(jié)果權(quán)重影響大于50%。詳見(jiàn)圖6。

圖4 4個(gè)廠家肝復(fù)康丸的PLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig.4 PLS-DA scoring plot of Ganfukang Pills from four manufacturers

圖5 16批肝復(fù)康丸的PLS-DA載荷散點(diǎn)圖Fig.5 PLS-DA loading plot of 16 batches of Ganfukang Pills

圖6 PLS-DA 變量重要性投影值圖Fig.6 Variable importance in the projection plot of PLS - DA

3 討論

3.1 指認(rèn)指標(biāo)選擇

肝復(fù)康丸的君藥五味子來(lái)源于木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，其藥理作用為保肝、抗氧化、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。五味子含有木脂素、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖等多種化合物，其中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素在木脂素類成分中含量高［12-13］。太子參藥食兩用，具有健脾益氣、潤(rùn)肺生津功效，為石竹科孩兒參干燥塊根，廣泛用于治療肝炎、心絞痛及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等癥，主要活性成分為太子參環(huán)肽類、氨基酸類、脂肪酸類、微量元素類等，且太子參環(huán)肽B 較其他環(huán)肽含量大［14-15］。民間最常用的抗腫瘤中草藥為白花蛇舌草，以全草入藥，味苦、甘，性寒，常用于治療肝炎、咽喉痛、肝癌、胃癌等癥［16-17］，目前從白花蛇舌草中分離出的化學(xué)成分主要有環(huán)烯醚萜類化合物（車葉草苷和去乙酰車葉草酸酐）、黃酮類化合物（槲皮素和山柰素）及有機(jī)酸類（阿魏酸和4-香豆酸）等。故本研究中選擇五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、車葉草苷、去乙酰車葉草酸酐、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰素、阿魏酸、4 - 香豆酸為指認(rèn)指標(biāo)，并考察方中指標(biāo)性成分對(duì)不同廠家樣品質(zhì)量穩(wěn)定性的影響［18］。

3.2 色譜條件選擇

曾考察不同檢測(cè)波長(zhǎng)（190～400 nm），流動(dòng)相不同溶劑（有機(jī)相為甲醇或乙腈，無(wú)機(jī)相為0.05%磷酸或0.05%醋酸）及同梯度比例，不同柱溫（25，30，35 ℃），不同流速（0.8，0.9，1.0 mL/min），不同超聲提取次數(shù)（1次、2次、3次），不同品牌色譜柱（Kromasil C18柱、Agilent Ecilipse C18柱）及不同品牌高效液相色譜儀（Agilent1260型高效液相色譜儀、UItimate 型高效液相色譜儀）對(duì)肝復(fù)康丸HPLC 分析結(jié)果的影響，綜合分析色譜峰的數(shù)量、峰形分離效果，最終確定2.1 項(xiàng)下色譜條件作為肝復(fù)康丸HPLC疊加指紋圖譜的分析條件。

3.3 方法評(píng)價(jià)

建立的HPLC 指紋圖譜操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，與PLS- DA 技術(shù)結(jié)合，可為肝復(fù)康丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。