周 岳，韓 博

1.西安大興醫(yī)院普通外科，陜西西安 710000；2.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院消化外科，陜西西安 710100

結(jié)腸癌是一種較為常見的消化道惡性腫瘤，多發(fā)生于直腸與結(jié)腸的交界處。以40～50歲年齡段發(fā)病率最高，占所有惡性腫瘤的10%～15%[1]。近年結(jié)腸癌發(fā)病率逐年上升，其早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時常已是中晚期，預(yù)后不佳[2]?；诜肿由飳W(xué)的研究為臨床腫瘤發(fā)病機制探究提供了方向，也為臨床提供了新的腫瘤治療靶點。近來研究發(fā)現(xiàn)，p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在多種腫瘤如宮頸癌、卵巢癌、肺癌細(xì)胞的發(fā)生、凋亡、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。p38 MAPK作為結(jié)腸癌研究的一個靶點，在早期診治、臨床分期及預(yù)后等方面至關(guān)重要。本研究通過免疫組化法檢測p38蛋白在人結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達情況，探討p38蛋白的表達與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集2015年6月至2017年6月在西安大興醫(yī)院接受手術(shù)治療的110例結(jié)腸癌患者腫瘤組織及癌旁組織(距病灶邊緣1.5～2.0 cm)石蠟標(biāo)本，組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷，患者術(shù)前均未行任何相關(guān)治療，臨床資料和隨訪資料完整，患者既往均無惡性腫瘤病史，未合并其他惡性腫瘤。

1.2方法

1.2.1資料收集及隨訪 收集入組患者臨床病理資料包括年齡、性別、腫瘤最大徑、病理TNM分期、浸潤程度、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。術(shù)后對所有患者進行隨訪，截至2020年9月，以死亡作為觀察終點，觀察患者腫瘤復(fù)發(fā)、生存情況。

1.2.2試劑 兔抗人p38單克隆抗體購自美國Abcam公司；BCA蛋白檢測試劑盒、蛋白裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自賽默飛世爾科技公司。

1.2.3免疫組織化學(xué)法檢測p38蛋白表達 將組織石蠟標(biāo)本以4 mm厚度連續(xù)切片，烤片20 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，將切片放入枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，清除抗原修復(fù)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，5%牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉30 min，滴加p38一抗(1∶50)，4 ℃冰箱孵育過夜；次日取出切片，PBS洗滌3次，滴加山羊抗IgG二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，加入DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹脂封片，鏡下觀察拍照。

1.3結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) p38陽性染色主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。每張切片隨機取10個視野，通過染色強度和陽性細(xì)胞百分比計算評分。著色強度無著色、黃色、棕黃色、棕褐色依次記為0、1、2、3分，陽性細(xì)胞百分比≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%依次記為0、1、2、3、4分。兩項評分乘積為總分，總分<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)數(shù)據(jù)采用例數(shù)、率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier生存曲線分析p38蛋白表達與結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)系，并行Log-rank檢驗；采用Cox比例風(fēng)險模型分析患者生存影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)腸癌組織中p38蛋白表達情況 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示，p38蛋白主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色，見圖1。110例結(jié)腸癌組織中，p38蛋白陽性表達率為80.9%(89/110)，對應(yīng)癌旁組織中陽性表達率為7.3%(8/110)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：A為p38蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達情況；B為p38蛋白在癌旁正常組織中的情況表達。

2.2p38蛋白表達與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)免疫組化結(jié)果將入組患者分為p38蛋白陽性表達組(89例)和陰性表達組(21例)，單因素分析結(jié)果顯示，p38蛋白表達與腫瘤浸潤程度、TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤最大徑無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 p38蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3p38蛋白表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪至2020年9月，110例結(jié)腸癌患者中失訪5例，所有入組患者的3年總生存率為60.0%(66/110)，3年無復(fù)發(fā)生存率為49.1%(54/110)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，p38蛋白陽性表達組總生存率、無復(fù)發(fā)生存率低于陰性表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rankχ2=4.094、4.428，P=0.043、0.035)。見圖2。

注：A為結(jié)腸癌術(shù)后3年總生存情況；B為結(jié)腸癌術(shù)后3年無復(fù)發(fā)生存情況。

2.4結(jié)腸癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析 單因素分析顯示，腫瘤浸潤程度侵及漿膜、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中/低分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及p38蛋白表達陽性是結(jié)腸癌患者死亡的危險因素(P<0.05)；腫瘤最大徑和上述因素亦是結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)的危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 結(jié)腸癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

續(xù)表2 結(jié)腸癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

2.5結(jié)腸癌患者預(yù)后影響因素的多因素Cox比例風(fēng)險模型分析 納入表2中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量行多因素Cox比例風(fēng)險模型分析，結(jié)果顯示，腫瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中/低分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p38蛋白陽性表達是結(jié)腸癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。而腫瘤最大徑>5 cm、浸潤程度為侵及漿膜、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中/低分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及p38蛋白陽性表達是結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表3 結(jié)腸癌患者死亡影響因素的多因素Cox比例風(fēng)險模型分析

表4 結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)影響因素的多因素Cox比例風(fēng)險模型分析

3 討 論

臨床結(jié)腸癌治療仍以外科手術(shù)為主。研究發(fā)現(xiàn)，早期結(jié)腸癌5年生存率可達90%以上，而進展期5年生存率不到5%[6]。因此，探究與結(jié)腸癌相關(guān)的早期診斷標(biāo)志物及預(yù)后影響因素，對提高患者預(yù)后具有重要意義。p38是MAPK信號途徑的重要組成部分，研究證實激活的p38 MAPK可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中的多種生物學(xué)反應(yīng)[7-9]。且近年研究表明，結(jié)腸癌中p38 mRNA高表達可促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，敲低p38表達后結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性程度降低[10]。因此，基于臨床病理探究p38在結(jié)腸癌中的表達及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，對結(jié)腸癌的早期診斷、治療及預(yù)后評估具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中p38蛋白陽性高表達，提示p38過表達在結(jié)直腸癌中扮演重要角色。同時發(fā)現(xiàn)，p38蛋白表達與腫瘤浸潤程度、TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤獲得轉(zhuǎn)移潛能，引起疾病進展的關(guān)鍵，也是腫瘤患者預(yù)后不良的危險因素[11]。腫瘤分化程度越低預(yù)示著臨床分期越高，腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤及術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險也升高[11]。相關(guān)研究表明，乳腺癌組織中p38蛋白高表達與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]；p38參與調(diào)控食管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為進程，與腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤深度等病理特征關(guān)系密切，是判斷食管癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移的有效標(biāo)志物[13]。p38蛋白高表達預(yù)示著腫瘤浸潤程度加深、臨床分期更晚、分化程度更低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加。由此表明，p38高表達與腫瘤惡性病理特征相關(guān)，促進了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移。本研究進一步分析p38蛋白表達與結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，p38陽性表達患者具有更低的3年總生存率與無復(fù)發(fā)生存率，且p38是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素，其陽性表達患者發(fā)生死亡、復(fù)發(fā)的風(fēng)險是陰性患者的1.494、1.651倍，提示可將p38蛋白作為評估結(jié)腸癌惡性進展及預(yù)后不良的潛在預(yù)測指標(biāo)。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中p38蛋白陽性高表達，與腫瘤浸潤程度、TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征及患者預(yù)后有關(guān)，可將其作為評估結(jié)腸癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制還需進一步研究。