胡 珊，梁衛(wèi)驅(qū)，黃 皓，侯 晨，陳杰連，徐 匆，羅華建，連輝明，陳仕麗，謝佩吾*

(1.東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心，廣東東莞 523000；2.廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510520)

樟樹(Cinnamomumcamphora)，又名香樟、烏樟、樟木、芳樟等，是亞熱帶地區(qū)重要的材用和特種經(jīng)濟(jì)樹種，其根、木材、枝、葉均可提取精油[1]。樟樹精油具有芳香氣味和良好的防腐、消炎、抗病毒、殺菌、殺蟲等活性，目前被應(yīng)用于香料、醫(yī)藥和食品工業(yè)等行業(yè)，具有廣闊的研究前景[2-3]。樟樹精油成分因各個(gè)地域的環(huán)境、氣候等差異而不盡相同。大多數(shù)學(xué)者根據(jù)樟樹精油的成分所含的主要化學(xué)成分的不同將其劃分為5種化學(xué)型：主含芳樟醇(17.30%～84.83%)的芳樟型、主含樟腦(10.00%～75.03%)的樟腦型、主含桉葉油素(30.70%～58.51%)的油樟型、主含異橙花叔醇(20.74%～42.00%)的異樟型、主含龍腦(67.06%～81.78%)的龍腦樟型[4-7]。不同化學(xué)型樟樹精油的化學(xué)成分和理化性質(zhì)不同，生物活性亦有差異。樟樹精油的大多數(shù)化學(xué)成分有殺菌、抑菌的作用。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)樟樹精油對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、雞沙門氏菌和大腸桿菌等具有良好的抗菌活性。陶翠等[9]研究發(fā)現(xiàn)油樟葉揮發(fā)油對(duì)須毛癬菌、犬小孢子菌和石膏小孢子菌 3株真菌具有較強(qiáng)的抗真菌活性。鄧海英等[10]研究樟樹葉乙醇提取物和水提取物對(duì)4種細(xì)菌的抗菌活性，結(jié)果表明2種提取物對(duì)G+菌及G-菌均有不同程度的抑制作用。胡小剛等[11]在芳樟醇R-和S-對(duì)映異構(gòu)單體的體外抗菌活性研究中發(fā)現(xiàn)，2種芳樟醇對(duì)金黃色葡萄球菌等細(xì)菌均具有抗菌活性，R-芳樟醇對(duì)部分細(xì)菌抗菌活性稍強(qiáng)于S-芳樟醇。Pragadheesh等[12]研究發(fā)現(xiàn)樟樹精油對(duì)瓜褐腐病有良好的抑制作用。有關(guān)樟樹精油抑菌作用的研究已有較多報(bào)道，其中主要研究同種化學(xué)型對(duì)不同菌的抑菌作用，而針對(duì)不同化學(xué)型樟樹精油對(duì)相同病原菌的抑菌作用比較分析鮮見報(bào)道。該研究選取應(yīng)用較為廣泛2種化學(xué)型(芳樟型和龍腦樟型)樟樹，采用水蒸氣蒸餾法提取2種樟樹葉的精油，利用GC-MS 法對(duì)比分析2種樟樹葉精油化學(xué)成分的差異，并以多種常見的農(nóng)作物病害病原菌為研究對(duì)象進(jìn)行抑菌作用研究，以期為拓寬樟樹精油的開發(fā)利用思路和開發(fā)綠色安全植物病原菌防治藥劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1新鮮樟樹樹葉。龍腦樟由廣東華清園生物科技有限公司提供；芳樟由廣東省林業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.1.2培養(yǎng)基。馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.1.3供試植物病原菌。甘蔗赤腐病菌(ColletotrichumfalcatumWent)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、花生褐斑病菌(CercosporaarachidicolaHori)、水稻惡苗病菌(FusariummoniliformeSheld)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系贈(zèng)送。冬瓜根腐病菌(Fusariumsolani)、苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.momdicae)、冬瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum(schl.)f.sp.benincasae)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)，由東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心分離保存。

1.1.4試驗(yàn)設(shè)備。GCMS-QP2020W/O氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；TC-15套式恒溫器(海寧市華星儀器廠)；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；SW-CJ-1F 潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；LRH-250 生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1精油提取[13]。采用《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)附錄XD水蒸氣蒸餾法提取龍腦樟樹葉和芳樟樹葉葉片精油。為減少揮發(fā)，采摘回實(shí)驗(yàn)室的鮮葉在7 d內(nèi)按照采樣順序完成精油提取工作。所得精油在0～5 ℃條件下保存，用于精油成分分析。

1.2.2樟樹葉精油成分分析。

1.2.2.1氣相條件(GC)。升溫程序：初始柱溫為70 ℃，以2 ℃/min 速度升溫至160 ℃保持2 min，再以10 ℃/min速度升溫至220 ℃，保持5 min，全程共運(yùn)行51 min。進(jìn)樣量0.5 μL，采用分流的方式進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度230 ℃。載氣為氦氣，過柱載氣恒流速為1.19 mL/min。

1.2.2.2質(zhì)譜條件(MS)。離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍(m/z)50～500。溶劑延遲3 min。

1.2.2.3化合物鑒定。將總離子流圖中各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行檢索分析鑒定，并采用峰面積歸一定量法計(jì)算各組分在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量[14]。

1.2.3樟樹葉精油抑菌作用。

1.2.3.1植物精油配制。在無菌條件下，將植物精油用3%吐溫-80乳化劑溶液稀釋配制為500 mg/L精油溶液。

1.2.3.2真菌病原菌抑制試驗(yàn)。用6 mm打孔器打取植物病原真菌菌餅移至PDA平板中央，在距菌餅約2 cm處等距離呈等邊三角形的3點(diǎn)打孔，每個(gè)孔內(nèi)加100 μL樟樹葉精油溶液，每處理3次重復(fù)，以3%吐溫-80乳化劑溶液為陰性對(duì)照，不添加任何物質(zhì)的處理為空白對(duì)照。所有處理平板放置28 ℃培養(yǎng)至空白對(duì)照菌落長(zhǎng)滿，測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算抑制率[15]。抑制率=(空白對(duì)照菌落直徑-乳化劑處理菌落直徑-精油處理菌落直徑)/空白對(duì)照菌落直徑×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法采用SPSS 17.0 及Microsoft Excel 2007 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以最小顯著性差異法(LSD)多重比較檢驗(yàn)不同處理之間的差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同化學(xué)型樟樹葉精油的化學(xué)成分分析通過對(duì)不同化學(xué)型樟樹葉精油GC-MS分析得到總離子流圖進(jìn)行譜庫(kù)匹配和人工鑒定，使用峰面積歸一化法確定各化學(xué)成分的相對(duì)含量，結(jié)果見表1。芳樟和龍腦樟2種精油經(jīng)弱極性色譜柱分析鑒定出共52種化合物，精油成分組成以單萜類和倍半萜類為主，相對(duì)成分總含量分別99.31%、99.98%。

表1 2種不同化學(xué)型樟樹葉精油的GC-MS 分析結(jié)果

芳樟精油共分析鑒定出39種化合物，其中醇類化合物9種，相對(duì)含量為73.50%；烯類化合物24種，相對(duì)含量為18.97%，此外，還鑒定出1種烴類、1種苯類、2種酚類、1種醚類和1種酮類化合物。該化學(xué)型精油中相對(duì)含量超過1%的主要化學(xué)成分有芳樟醇(53.73%)、反式-橙花叔醇(8.87%)、蒿酮(4.46%)、桉葉油醇(4.45%)、石竹烯(4.12%)、樟腦(3.33%)、α-石竹烯(3.29%)、順β-羅勒烯(1.65%)、β-芘澄茄烯(1.49%)、α-松油醇(1.26%)、6-芹子烯-4-醇(1.09%)。

龍腦樟精油共分析鑒定出28種化合物，其中醇類化合物10種，相對(duì)含量為87.07%；烯類化合物12種，相對(duì)含量為9.63%，此外，還鑒定出1種烴類、1種酯類、3種酮類和1種酸類化合物。該化學(xué)型精油中相對(duì)含量超過1%的主要化學(xué)成分有龍腦(80.69%)、左旋乙酸冰片酯(2.84%)、α-石竹烯(2.46%)、石竹烯(2.18%)、氧化石竹烯(1.82%)、匙葉桉油烯醇(1.78%)、α-松油醇(1.41%)、樟腦(1.32%)、β-芹子烯(1.06%)。

2種化學(xué)型樟樹葉精油共同鑒定出的化合物為15種。其中，8種烯類(α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、石竹烯、α-石竹烯、氧化石竹烯)，6種醇類(桉葉油醇、α-松油醇、樟腦、龍腦、松油烯-4-醇、芳樟醇)，1種烴類(β-傘花烴)。這些化學(xué)成分與前人研究報(bào)道的不同化學(xué)型樟樹的主要揮發(fā)性化合物一致[16]。芳樟精油中主要成分為芳樟醇，相對(duì)含量為53.73%。龍腦樟精油中主要成分為龍腦，相對(duì)含量為80.69%。

2.2 樟樹葉精油抑菌作用該試驗(yàn)研究比較2種不同化學(xué)型樟樹葉精油在500 mg/L濃度下對(duì)玉米小斑病等10種植物真菌病原菌的抑菌活性，結(jié)果如表2和圖1～2所示。由表2和圖1可知，2種樟樹葉精油對(duì)甘蔗赤腐病菌、玉米小斑病菌、冬瓜根腐病菌、花生褐斑病菌、苦瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、水稻惡苗病菌8種病原菌均有不同程度的抑制作用，對(duì)蘋果輪紋病菌和小麥赤霉病菌無抑制作用。

圖1 2種不同化學(xué)型樟樹葉精油的抑制作用

表2 2種不同化學(xué)型樟樹葉精油對(duì)8種植物病原菌的抑菌菌落直徑

由圖2可知，2種樟樹葉精油對(duì)不同真菌的抑菌率相差較大。其中，芳樟精油對(duì)8種病原菌抑制率在11.51%～71.51%，對(duì)苦瓜枯萎病菌和甘蔗赤腐病菌的抑制率達(dá)70%以上；龍腦樟精油對(duì)8種病原菌抑制率在10.89%～63.54%，對(duì)甘蔗赤腐病菌的抑制率最高。2種精油除對(duì)玉米小斑病菌、冬瓜枯萎病菌、水稻惡苗病菌3種病菌的抑制作用無顯著差異外，芳樟精油對(duì)其余5種病原菌抑菌效果均顯著優(yōu)于龍腦樟精油。此外，2種精油對(duì)甘蔗赤腐病菌均有較好的抑制作用。

注：不同小寫字母表示同種植物病原菌不同化學(xué)型樟樹葉精油間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

樟樹是我國(guó)亞熱帶常綠闊葉林中的重要組成樹種，分布廣泛，資源豐富，其精油成分富含芳樟醇、樟腦、1，8-桉葉油素、龍腦、異橙花叔醇和黃樟油素等重要天然成分。精油是樟樹新陳代謝過程中次生代謝的產(chǎn)物，基因遺傳表達(dá)、生境共同作用會(huì)導(dǎo)致它產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳變異，因種類、種植地、季節(jié)等因素的不同，樟樹葉精油的產(chǎn)油率、化學(xué)成分、理化性質(zhì)都不同[17]。因此掌握樟樹精油的化學(xué)組成是對(duì)其進(jìn)行開發(fā)利用的前提。該研究中芳樟、龍腦樟樹葉提取水蒸精油進(jìn)行化學(xué)成分分析鑒定出52種化合物，精油成分組成以單萜類和倍半萜類為主。芳樟精油分析鑒定出39種化合物，其中醇類化合物9種、烯類化合物24種，主要成分為芳樟醇(53.73%)。龍腦樟精油分析鑒定出28種化合物，其中醇類化合物10種、烯類化合物12種，主要成分為龍腦(80.69%)。該研究中芳樟、龍腦樟樹葉采自廣東省，其化學(xué)成分分析結(jié)果與付宇新等[18]研究采自江西省的2種同化學(xué)型樟樹葉提取精油的分析結(jié)果不一致。而該研究中龍腦樟樹葉精油化學(xué)成分分析結(jié)果與丁雄等[19]研究同樣采自廣東省的龍腦樟樹葉精油的分析結(jié)果較為接近，主要成分龍腦的含量分別為80.69%和81.58%。這說明不同地區(qū)相同化學(xué)型的樟樹葉精油的主要成分存在一定的差異。

近年來，樟樹精油的生物活性研究備受關(guān)注。已有研究報(bào)道芳樟型和龍腦樟型樟樹精油具有良好的抑菌活性。丁雄等[19]研究發(fā)現(xiàn)龍腦樟葉水蒸揮發(fā)油及其主要成分右旋龍腦對(duì)試驗(yàn)所選的細(xì)菌、酵母菌和霉菌3類微生物均表現(xiàn)出一定的抗菌效果。鄭紅富等[20]采用水蒸氣蒸餾法提取芳樟精油主要成分芳樟醇為 89.58%，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)試質(zhì)量濃度為500、250和125 mg/L 時(shí)芳樟精油對(duì)水稻紋枯病菌具有良好的抑菌活性，抑制率分別為100%、90.88%和67.94%。目前，2種化學(xué)型樟樹精油對(duì)不同菌的殺菌作用研究較多，而2種化學(xué)型樟樹精油對(duì)同種菌抑制作用的比較還鮮少研究。該研究比較2種不同化學(xué)型樟樹精油在500 mg/L 濃度下對(duì)玉米小斑病等10種植物真菌病原菌的抑菌活性，2種樟樹精油對(duì)甘蔗赤腐病菌、玉米小斑病菌、冬瓜根腐病菌、花生褐斑病菌、苦瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、水稻惡苗病菌8種病原菌均有不同程度的抑制作用，對(duì)蘋果輪紋病菌和小麥赤霉病菌無抑制作用。2種精油除對(duì)玉米小斑病菌、冬瓜枯萎病菌、水稻惡苗病菌3種病菌的抑制作用無顯著差異外，芳樟精油對(duì)其余5種病原菌抑菌效果均顯著優(yōu)于龍腦樟精油。該研究結(jié)果為芳樟和龍腦樟樟樹葉精油的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。