王秀禎 林志敏 林彬彬 謝碧林 翁漢東 莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建莆田 351100

由鴨疫里默氏菌引起的鴨病稱為鴨傳染性漿膜炎。該病又名鴨疫巴氏桿菌病、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合征等[1]，以敗血癥多見，以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎為主要臨床特征[2]，部分病例還出現(xiàn)干酪樣輸卵管炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎等特征。鴨疫里默氏菌主要感染1～8周齡鴨，病亡率可達(dá)75%，是養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一[3]。

2022年3月，莆田市荔城區(qū)某鴨場送檢6羽雛番鴨，臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、腿軟無力、顫抖怕冷，眼渾濁、鼻有黏液性分泌物流出，排白色水樣稀糞，瀕臨死亡時(shí)鴨不停甩頭、抽搐，仰臥作劃水狀。病例解剖發(fā)現(xiàn)心臟、氣囊有大量纖維素性滲出物附著，肝脾腫大、有壞死灶。根據(jù)臨床癥狀和解剖病理特征初步診斷為鴨疫里默氏菌病，為進(jìn)一步確診，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測和藥敏試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 病料采集 無菌采集莆田市荔城區(qū)某鴨場患鴨的心臟、肝臟、脾臟。

1.2 主要試劑與儀器TSA培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker均為天根生化科技有限公司產(chǎn)品，DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品，藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。恒溫培養(yǎng)箱，CO2培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，離心機(jī)，PCR擴(kuò)增儀，電泳儀、電泳槽，凝膠分析成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將無菌采集病料的心臟、肝臟、脾臟劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基、含5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中、TSA培養(yǎng)基置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長情況。挑取單個(gè)菌落接種于5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.3.2 鏡檢 挑取TSA培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.3.3 PCR鑒定 挑取TSA培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，用水煮法提取細(xì)菌DNA作為模板，引物為參考文獻(xiàn)[7]的鴨疫里默氏菌外膜蛋白OmpA基因引物（上游引物：ACTCAAGGAAGAGCGGATCA，下游引物：GCTTCAGCAGAACCAACTCC），預(yù)期擴(kuò)增片段為809 bp。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表1-表2。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀上觀察結(jié)果，用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的DNA，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對。

表1 PCR反應(yīng)體系（20 μL體系）

表2 PCR反應(yīng)條件

1.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用K-B紙片法。取100 μL分離菌純培養(yǎng)液于5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，用涂抹棒將菌液涂布均勻，待菌液干燥后將藥敏紙片有序放置，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，觀察測量抑菌圈直徑并記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上不生長，在5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上生長出圓形、灰白色、表面光滑、直徑約1 mm的菌落，符合鴨疫里默氏菌的菌落特征。

2.2 鏡檢結(jié)果 經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢顯示菌體呈革蘭氏陰性短小桿菌。

2.3 PCR鑒定結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，檢測菌目的條帶位于750～1 000 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致。PCR產(chǎn)物測序后，經(jīng)Blast分析比對，與鴨疫里默氏菌OmpA基因序列的相似性為99.6%，確定該分離菌為鴨疫里默氏菌。

圖1 鴨疫里默氏菌OmpA基因PCR擴(kuò)增

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）中的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，分離菌對14種抗菌藥物的敏感試驗(yàn)結(jié)果見表3。分離菌株對氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑林、強(qiáng)力環(huán)素、氟苯尼考敏感，對恩諾沙星中度敏感，對硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、阿米卡星、紅霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、多粘菌素耐藥。

表3 鴨疫里默氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、鏡檢、PCR檢測，確定該分離菌為鴨疫里默氏菌。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該分離菌對氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑林、強(qiáng)力環(huán)素、氟苯尼考敏感，對恩諾沙星中度敏感，對硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、阿米卡星、紅霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、多粘菌素耐藥，該結(jié)果對臨床上指導(dǎo)用藥有幫助。

鴨疫里默氏菌血清型眾多，目前世界上公認(rèn)的血清型有21種，且出現(xiàn)了一些未鑒定的血清型[4-7]，各血清型間缺乏交叉免疫保護(hù)，給疫苗免疫預(yù)防帶來困難。在臨床上對該病大多采用抗生素進(jìn)行治療，但由于大量抗生素的濫用，造成鴨疫里默氏菌的耐藥性不斷增強(qiáng)。因此，及時(shí)選擇合適的敏感藥物進(jìn)行對癥治療至關(guān)重要。建議莆田市荔城區(qū)該鴨場選擇氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑林、強(qiáng)力環(huán)素、氟苯尼考等藥物進(jìn)行治療。同時(shí)，鴨場要做好防控工作，定期做好消毒和防疫措施，交替使用消毒藥物以避免產(chǎn)生耐藥性，做好禽流感、鴨瘟等疫病的免疫工作，并及時(shí)跟蹤免疫抗體監(jiān)測；改善鴨場飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生條件，注意飼養(yǎng)密度、通風(fēng)、干燥、溫度，減少應(yīng)激、勤換墊料等。