劉凡語，安立昆，姚曉華，姚有華，崔永梅，白羿雄，李 新，吳昆侖

（青海大學農(nóng)林科學院，青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實驗室，青海省青稞遺傳育種重點實驗室，國家麥類改良中心青海青稞分中心，青海 西寧 810016）

青稞（Hordeum vulgareL. var.nudumHook. f.）是青藏高原地區(qū)最具特色的作物，是當?shù)鼐用褓囈陨娴募Z食和飼料、食品加工原料，在青藏高原農(nóng)業(yè)歷史文化和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展中有著重要的地位[1-4]。青藏高原地區(qū)氣候惡劣，青稞在青藏高原有著悠久的栽培歷史，雖然青稞已經(jīng)適應了青藏高原的惡劣條件，但是各種逆境脅迫，尤其是貧瘠的土壤依然嚴重制約著青稞的種植和生產(chǎn)[5-8]。氮元素是影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)的重要大量元素之一。在作物的種植過程中為了提高產(chǎn)量，會施用大量的氮肥。然而，氮肥施用過量和氮肥流失一直是困擾我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重大問題[9]。長期過量施用氮肥會造成土壤結(jié)構(gòu)破壞，流失的氮肥還會污染農(nóng)田周邊環(huán)境，不利于生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[10]。因此，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中氮肥的施用量、提高作物對氮肥的利用效率對于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。青稞主要種植地集中在生態(tài)極為脆弱敏感的青藏高原地區(qū)，長期大量施用氮肥會對青藏高原地區(qū)生態(tài)環(huán)境平衡造成嚴重破壞[11-13]。因此，在保證青稞產(chǎn)量的同時，盡可能減少青稞生產(chǎn)過程中氮肥的施用，對青藏高原農(nóng)業(yè)生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族NPFs 是廣泛存在于各種植物中的一類低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族，其主要功能是在植物體受到低氮脅迫時對硝酸鹽進行吸收和轉(zhuǎn)運，此外還參與植物次生代謝產(chǎn)物以及激素等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運[14-15]。很多研究表明，NPFs 家族中一些成員參與菌根調(diào)控的硝酸鹽吸收和同化過程。楊曉鋒[16]研究水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因OsNPF4.5時發(fā)現(xiàn)，OsNPF4.5位于水稻第1 條染色體上，具有7 個外顯子和6 個內(nèi)含子，可編碼609 個氨基酸，亞細胞定位結(jié)果顯示其蛋白位于細胞膜上，該基因的表達受叢枝菌根強烈誘導，而同一家族的其他基因表達并不受叢枝菌根的影響，此外該基因的表達受外源硝酸鹽的誘導，外源的脫落酸和水楊酸會抑制其表達。Wang 等[17]發(fā)現(xiàn)水稻OsNPF4.5 蛋白定位于細胞膜上，與玉米ZmNPF4.5 和高粱SbNPF4.5 親緣關(guān)系最近，是一種參與水稻菌根吸收和同化硝酸鹽的低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白；將OsNPF4.5轉(zhuǎn)入水稻中，轉(zhuǎn)基因植株的氮素吸收效率明顯高于野生型植株，且生長速度加快，其菌根途徑貢獻的氮大約有45%通過OsNPF4.5 轉(zhuǎn)運，表明OsNPF4.5 在禾本科植物通過菌根途徑吸收利用硝酸鹽的過程中起主導作用。黃圣宇[18]對枳硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因PtrNPF5.2進行了研究，發(fā)現(xiàn)PtrNPF5.2具有12 個跨膜結(jié)構(gòu)，在第6～7 跨膜域間存在一個大親水環(huán)，其蛋白定位于細胞膜上，符合硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族的典型特征，PtrNPF5.2主要在與叢枝菌共生的細胞中表達，表明該基因可能參與菌根調(diào)控的硝酸鹽吸收和同化過程。馮慧敏等[19]的研究表明，水稻OsNPF7.9基因表達的蛋白定位于細胞膜上，有12 個跨膜結(jié)構(gòu)，在葉片、花和根中都有表達，但其表達不受硝態(tài)氮或銨態(tài)氮及其濃度差異的影響，將其轉(zhuǎn)入水稻中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株由根系向地上部的硝酸鹽轉(zhuǎn)運能力增強，表明OsNPF7.9 在植物將硝酸鹽從根系向地上部轉(zhuǎn)運的過程中發(fā)揮著重要的作用。夏秀東[20]的研究表明，水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因OsNPF2.4由2個內(nèi)含子和3 個外顯子組成，其蛋白由583 個氨基酸組成，有12 個跨膜結(jié)構(gòu)，定位于質(zhì)膜上，在葉鞘、葉片、花粉和剛萌發(fā)的幼芽中均有表達，主要在根的表皮細胞、木質(zhì)部薄壁細胞等中表達，另外，該基因敲除突變體對NO3-的吸收量明顯低于野生型，說明OsNPF2.4的敲除會影響水稻體內(nèi)的運輸，而其過表達會顯著增加水稻對的吸收。

目前，關(guān)于植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因NPFs家族的研究在青稞中尚未見報道。該研究從 “昆侖14”青稞中克隆得到青稞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因HvnNPF4.5，對其基因和蛋白結(jié)構(gòu)進行了生物信息學分析，并對其亞細胞定位進行了研究，以期為青稞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白進一步研究利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試青稞品種“昆侖14”以及對照品種本氏煙草（Nicotiana benthamiana）均由青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實驗室保存。TransZol Up Plus RNA 提取試劑盒和PCR 產(chǎn)物連接及cDNA 合成試劑盒EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（AE301-03）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。高保真PCR酶PrimeSTAR 和Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR 克隆試劑盒購自Takara 寶生物工程（大連）有限公司。Gateway 克隆試劑盒購自Invitrogen 公司。大腸桿菌感受態(tài)菌株為自制DH5α 感受態(tài)。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 青稞DNA 和RNA 提取采用CTAB 法從青稞葉片中提取DNA，采用TransZol Up Plus RNA 提取試劑盒從青稞葉片中提取RNA，并參照cDNA 合成試劑盒合成cDNA，所有樣品于-20℃冰箱保存。

1.2.2 青稞HvnNPF4.5 基因克隆和啟動子區(qū)域序列克隆將已報道的水稻OsNPF4.5基因序列輸入NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 搜 索 得 到大麥HvNPF4.5，根據(jù)其基因和起始密碼子ATG 前2 000 bp 序列設(shè)計引物。基因克隆正向引物F：5'-ATG TACTTCATGTTGGTGATG-3'，反向引物R：5'-CTACAT GACAGACTTGCTG-3'。啟動子區(qū)域序列克隆正向引物F：5'-CGTGCGTGCTAACGTTCT-3'，反向引物F：5'-GA TAAGGTTCACGGCTAGA-3'。以青稞基因組cDNA 和DNA 為模板分別克隆青稞HvnNPF4.5序列和啟動子區(qū)域序列。PCR 程序為：94℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃30 s，68℃ 1 min（擴增啟動子區(qū)域序列為2 min），35個循環(huán)；4℃保存。將PCR 產(chǎn)物與TA 克隆載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆進行測序。

1.2.3 青稞HvnNPF4.5 生物信息學分析使用GSDS 2.0（http://gsds.gao-lab.org/）對基因結(jié)構(gòu)進行預測。使用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/web tools/plantcare/html/）對啟動子區(qū)域元件進行預測分析。使 用Protparam（https://web.expasy.org/protparam/） 對蛋白質(zhì)的物理和化學性質(zhì)進行預測。使用kinasephos2（http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/index.php）對蛋白磷酸化位點進行預測。使用SignalP 5.0 服務器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對蛋白信號肽進行預測分析。使用TMHMM-2.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對跨膜結(jié)構(gòu)進行預測。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）對蛋白預測二級結(jié)構(gòu)進行分析。使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，生成三級結(jié)構(gòu)再建模。

在NCBI 中搜索得到擬南芥（Arabidopsis thaliana）、甘藍型油菜（Brassica napusL.）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii subsp.tauschii）、水稻（Oryza sativaL.）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、玉米（Zea maysL.）、羊黍（Panicum hallii）、黍稷（Panicum miliaceum）、柳枝稷（Panicum virgatum）、二型花（Dichanthelium oligosanthes）、小米（Setaria italica）、狗尾草（Setaria viridis）、南荻（Miscanthus lutarioriparius）、高粱（Sorghum bicolor）、大麥（Hordeum vulgareL.）、康藏嵩草（Carex littledalei）、蘆筍（Asparagus officinalis）、山藥（Dioscorea cayenensissubsp.rotundata）、油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifera）、野芭蕉（Musa acuminatasubsp.malaccensis）、無 油 樟（Amborella trichopoda）、沉水樟（Cinnamomum micranthum）、毛果楊（Populus trichocarpa）、蓖麻（Ricinus communis）、甘藍型油菜（Brassica napus）、蘿卜（Raphanus sativus）、白菜型油菜（Brassica rapa）、鹽芥（Eutrema salsugineum）、亞 麻 芥（Camelina sativa）、薺 菜（Capsella rubella）的NPF4.5 蛋白。將擬南芥AtNPF4.5、甘藍型油菜BnNPF4.5、節(jié)節(jié)麥AtsNPF4.5、水稻OsNPF4.5、二穗短柄草BdNPF4.5、玉米ZmNPF4.5 的蛋白序列，采用DNAMAN7.0 與大麥HvNPF4.5 和青稞HvnNPF4.5蛋白序列進行比對，并根據(jù)NCBI 提供的蛋白信息分析各蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。將所有物種的NPF4.5 蛋白序列輸入MEGA7 中以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 青稞HvnNPF4.5 亞細胞定位研究采用載體pSATN1-mkate 利用gatway 方法構(gòu)建亞細胞定位載體。設(shè)計帶有attB 位點的引物，正向引物F：5'-GGGGAC AAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTACTTCATG TTGGTGATG-3'，反向引物R：5'-GGGGACCACTTTG TACAAGAAAGCTGGGTCATGACAGACTTGCTG-3'。對已克隆的HvnNPF4.5CDS 序列進行克隆，按照gatway 反應試劑盒說明書完成載體構(gòu)建，并對載體進行測序驗證。將構(gòu)建好的載體通過凍融法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105 中。制備好農(nóng)桿菌重懸液后將菌液注射入煙草葉片下表皮，置于全黑暗環(huán)境22℃培養(yǎng)3 d 后將葉片切成1.5 cm2大小，置于Nikon C2-ER 激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 HvnNPF4.5 生物信息學分析

2.1.1 HvnNPF4.5 的基因結(jié)構(gòu)和啟動子功能元件預測分析測序結(jié)果表明，青稞和大麥的HvnNPF4.5基因和啟動子序列一致，HvnNPF4.5所對應的轉(zhuǎn)錄本包含2 個內(nèi)含子和3 個外顯子（圖1）。HvnNPF4.5基因啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)48 個TATA-box 和23 個CAAT-box，以及一些與干旱和脫落酸、赤霉素、生長素等植物激素相關(guān)的響應元件，其中，關(guān)于干旱、脫落酸、赤霉素和生長素的順式作用元件各1 個（表1）。

圖1 青稞HvnNPF4.5 基因結(jié)構(gòu)圖

表1 青稞HvnNPF4.5 基因啟動子元件分析

2.1.2 HvnNPF4.5 蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析由表2 可知，HvnNPF4.5 由600 個氨基酸組成，是疏水穩(wěn)定蛋白，有12 個跨膜結(jié)構(gòu)（圖2）；HvnNPF4.5 蛋白序列中有5 個絲氨酸（Ser）、3 個蘇氨酸（Thr）、2 個酪氨酸（Tyr），共8 個磷酸化位點（圖3）；無信號肽（圖4）；HvnNPF4.5 蛋白二級結(jié)構(gòu)中α 螺旋、延長鏈、β 轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲分別占48.83%、11.83%、3.5%、35.83%（圖5）；對青稞HvnNPF4.5 蛋白進行同源建模生成三級結(jié)構(gòu)模型，其結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果基本一致（圖6）。

表2 青稞HvnNPF4.5 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

圖2 青稞HvnNPF4.5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測分析

圖3 青稞HvnNPF4.5 蛋白磷酸化位點預測

圖4 青稞HvnNPF4.5 蛋白信號肽預測

圖5 青稞HvnNPF4.5 蛋白二級結(jié)構(gòu)

圖6 青稞HvnNPF4.5 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測分析圖

2.1.3 NPF4.5 蛋白氨基酸序列對比和同源進化分析對青稞HvnNPF4.5 蛋白進行序列比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白均具有MFS（Major Facilitator Superfamily） 結(jié)構(gòu)域，青稞HvnNPF4.5 與大麥HvNPF4.5 的蛋白序列完全一致（圖7）。將青稞HvnNPF4.5 和其他28 種植物的同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)青稞HvnNPF4.5 與大麥HvNPF4.5、節(jié)節(jié)麥AtsNPF4.5 的親緣關(guān)系最近（圖8）。

圖7 青稞HvnNPF4.5 蛋白氨基酸序列對比分析

圖8 青稞HvnNPF4.5 蛋白與其他植物同源蛋白系統(tǒng)進化樹

2.2 青稞HvnNPF4.5 蛋白亞細胞定位結(jié)果

將注射了農(nóng)桿菌的煙草葉片在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在細胞膜上檢測到紅色熒光信號，說明HvnNPF4.5蛋白定位在細胞膜上（圖9）。

圖9 青稞 HvnNPF4.5 蛋白亞細胞定位

3 結(jié) 論

植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白分為高親和力和低親和力2 種類型，高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白主要是在正常條件下維持植物體對硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運，低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白主要是在植物體受到低氮脅迫時發(fā)揮作用，為植物提供更充足的氮元素[21-23]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因家族NPFs屬于低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，是植物吸收、轉(zhuǎn)運和同化硝酸鹽的主要基因家族，在植物氮元素吸收利用中發(fā)揮著重要作用[16,24-25]。

除了水稻等模式植物外，其他植物的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因家族NPFs研究報道也較多。袁婷婷等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，毛竹中有27 個NPFs家族基因成員，分為7 個亞家族，PeNPFs啟動子序列中包含多種與低溫和干旱等非生物脅迫以及GA3和NAA 等激素響應相關(guān)的元件，PeNPFs主要定位于細胞膜和液泡中，在葉片、花序、根、鞭和筍中均有表達，并且受多種非生物脅迫和植物激素的誘導表達，PeNPFs的不同成員在不同組織以及應對不同環(huán)境過程中發(fā)揮著多樣化的功能。王倩[27]的研究發(fā)現(xiàn)，73 個蘋果MdNPFs成員可分為8 個亞族，且分布在17 條染色體上，有12 個跨膜結(jié)構(gòu)域，在根、莖、葉、花和果實中均有表達，其表達受硝酸鹽濃度的影響，將其中的MdNPF6.5基因轉(zhuǎn)入蘋果愈傷組織中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因愈傷組織在低氮下鮮重明顯高于對照，表明MdNPF6.5在提高蘋果耐低氮能力方面具有重要作用。計麗[24]的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)木薯MeNPFs基因含有2～5 個內(nèi)含子，少數(shù)只含有1 個內(nèi)含子，72 個MeNPFs基因不均勻分布于18 條染色體上；進一步研究發(fā)現(xiàn)MeNPF6.2和MeNPF6.3有12 個跨膜結(jié)構(gòu)，均定位于細胞膜上，MeNPF6.2和MeNPF6.3分別在木薯葉片和幼苗根中受硝酸鹽誘導表達；將MeNPF6.2基因轉(zhuǎn)入木薯和水稻中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因木薯植株葉面積更大、莖桿更加粗壯、側(cè)根數(shù)量也明顯增多，轉(zhuǎn)基因水稻則表現(xiàn)為百粒重和粒寬顯著增加，表明MeNPF6.2基因在木薯響應低氮脅迫時起重要作用，在作物耐低氮改良過程中應用前景廣闊。馬嘉俊等[14]對白菜BrNPFs進行研究時發(fā)現(xiàn)，白菜BrNPFs基因家族成員分為8 個亞族，不均勻地分布在10 條染色體上，共有72 個成員，亞細胞定位預測結(jié)果顯示BrNPFs 均定位在質(zhì)膜上。筆者的研究結(jié)果與以上研究報道基本相符。HvnNPF4.5包含2 個內(nèi)含子，啟動子區(qū)有與干旱以及脫落酸、赤霉素、生長素相關(guān)的順式活性作用元件；HvnNPF4.5 蛋白的分子量為66 875.31 Da，理論等電點為8.85，具有8 個磷酸化位點，無信號肽結(jié)構(gòu)，也具有12 個跨膜結(jié)構(gòu)，在第6～7 跨膜域間同樣存在一個大親水環(huán)；HvnNPF4.5和其他物種的同源蛋白都有MFS 結(jié)構(gòu)域，青稞HvnNPF4.5 與大麥HvNPF4.5、節(jié)節(jié)麥AtsNPF4.5 的親緣關(guān)系最近；亞細胞定位結(jié)果顯示青稞HvnNPF4.5定位于細胞膜上。

青稞是青藏高原地區(qū)最具特色的作物，減少青稞生產(chǎn)中氮肥的施用量，提高青稞對氮肥的利用效率對于青稞種植業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。該研究克隆得到了青稞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因HvnNPF4.5，對其基因和蛋白進行了生物信息學分析，并對其進行亞細胞定位研究，其結(jié)果為青稞氮元素吸收、轉(zhuǎn)運和同化相關(guān)基因研究提供了一定的參考。