王德成，姜 鴻，趙 玥，鄒桂欣，王光函

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

化胃舒顆粒為我院臨床常用制劑，由黃芪、麥冬、紅參、茯苓、甘草、法半夏、烏梅等十三味中藥組成，具有益氣健脾、養(yǎng)陰和胃、降逆止嘔之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃芪、麥冬、紅參、茯苓、甘草、法半夏所含皂苷類及多糖類化合物分別具有抗腫瘤[1-6]、增強機體免疫力[7-8]、拮抗化療藥物副作用[9]、修復(fù)胃腸道黏膜等活性，烏梅所含有機酸具有促進(jìn)胃酸分泌、修復(fù)胃黏膜損傷、調(diào)整脾胃功能、調(diào)節(jié)胃腸蠕動功能等[10-12]作用。上述化學(xué)成分均與本品功能主治相關(guān)，起到治療或者減毒增效作用，且具有一定水溶性。因此擬采用正交實驗法，根據(jù)現(xiàn)階段國內(nèi)藥品生產(chǎn)企業(yè)水提取設(shè)備現(xiàn)狀，測定提取液中黃芪甲苷、總多糖、總皂苷、總有機酸的含量，結(jié)合逼近理想解排序法(TOPSIS)評價不同工藝條件的優(yōu)劣。TOPSIS是根據(jù)評價對象與理想化目標(biāo)的接近程度進(jìn)行順序優(yōu)選的一種多指標(biāo)決策分析方法，其將多維問題轉(zhuǎn)化為一維問題，降低了分析過程中不同類型指標(biāo)對決策的干擾，可以提高多目標(biāo)決策分析的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

本研究將TOPSIS法與正交試驗相結(jié)合，對化胃舒顆粒水提取的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期有效提高正交試驗結(jié)果的科學(xué)性。

1 材料與儀器

1.1 試藥

黃芪甲苷(批號：110781-200904)，D-無水葡萄糖(批號：110833-200904)人參皂苷Rg1(批號：110703-201027)購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇(美國迪馬公司)為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

1.2 儀器

Agilent11000 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech ELSD 2000ES)；Agilent8453 紫外可見分光光度計(美國安捷倫科技公司)；FA1004 電子分析天平(上海上天精密儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷含量測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C185 μm,250 mm×4.6 mm(翡納米科技有限公司)；流動相：乙腈-水(37∶63)；流速：1 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測器：漂移管溫度：105 ℃；氣體流速：3.0 L/min。

2.1.2 黃芪甲苷對照品溶液制備 取黃芪甲苷對照品，精密稱取10.2 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液(濃度為408 μg/mL)。精密吸取對照品儲備溶液2.5 mL，置10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為黃芪甲苷對照品溶液(濃度為102 μg/mL)。

2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取水提取液25 mL，加水30 mL，搖勻，水飽和正丁醇提取3次，每次25 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次25 mL，棄去氨試液，正丁醇液用正丁醇飽和水溶液洗滌2次，每次25 mL，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，并定量轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 測定方法 分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液5 μL、20 μL，供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算黃芪甲苷含量。黃芪甲苷對照品溶液和正交試驗水提取液供試品溶液HPLC色譜見圖1、圖2。

圖1 黃芪甲苷對照品HPLC色譜

圖2 提取液供試品HPLC色譜

2.1.5 供試品精密度試驗 精密吸取水提取液25 mL，按“2.1.3供試品溶液制備”項下方法制得供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，按“2.1.4測定方法”項下實驗，連續(xù)測定6次。其結(jié)果見表1。

表1 精密度實驗結(jié)果

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密吸取提取液25 mL，平行6份，分別按“2.1.3供試品溶液制備”項下方法制得供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，按“2.1.4測定方法”項下實驗。其結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果

2.2 總有機酸含量測定方法研究

2.2.1 氫氧化鈉滴定液配制 取氫氧化鈉適量，加蒸餾水振搖使成飽和溶液，冷卻后，置聚乙烯塑料瓶中，靜置數(shù)日，澄清后備用。取澄清后的氫氧化鈉飽和溶液5.6 mL，加新沸過的冷水使成1 000 mL，搖勻，得氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L)，備用。

標(biāo)定：取在105 ℃干燥至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀約0.6 g，平行3份，精密稱定，加新沸過的冷水50 mL，振搖，使其盡量溶解；加酚酞指示液2滴，用氫氧化鈉滴定液滴定，滴定至溶液顯粉紅色。每1 mL氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L)相當(dāng)于20.42 mg的鄰苯二甲酸氫鉀。計算F值，計算公式如下：

F=W/(20.42 mg/mL×10-3V)(W：鄰苯二甲酸的稱樣量；V：消耗的氫氧化鈉的體積)

3次平行試驗測得F的平均值為1.004。

2.2.2 硫酸滴定液配制 取濃硫酸1.2 mL，緩緩注入適量蒸餾水中，冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至1 000 mL，搖勻，得硫酸滴定液。標(biāo)定：取新配制的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，加水50 mL，混勻后，加入甲基橙試液2滴，用0.02 mol/L的硫酸滴定液滴定。平行操作5次，計算消耗硫酸滴定液體積的平均值，標(biāo)定硫酸滴定液的濃度。

2.2.3 水提取液中總有機酸測定 分別精密吸取正交實驗各次實驗水提取液15 mL，按照2015版《中華人民共和國藥典》四部電位滴定法與永停滴定法(通則0701)實驗。將水提取液置燒杯中，加水50 mL，搖勻，精密加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，加入轉(zhuǎn)子，連接電位滴定裝置，用0.02 mol/L的硫酸滴定，以指示電極的電位變化(△E)為縱坐標(biāo)，以滴定液體積變化(△V)為橫坐標(biāo)，繪制滴定曲線，以滴定曲線的陡然上升或下降部分的拐點為滴定終點，記錄消耗硫酸的體積。依據(jù)消耗硫酸的體積折算成消耗氫氧化鈉的體積，最終得到提取液中有機酸所消耗氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L)體積。每1 mL氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L)相當(dāng)于6.404 mg的枸櫞酸(C6H8O7)，以枸櫞酸(C6H8O7)計計算提取液中總有機酸含量。

2.3 水提取液中總多糖含量測定方法

2.3.1 葡萄糖對照品溶液制備 精密稱取無水葡萄糖對照品12.9 mg，置10 mL量瓶中，加蒸餾水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為葡萄糖對照品儲備溶液(濃度為1.29 mg/mL)。精密吸取對照品儲備溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，作為葡萄糖對照品溶液(濃度為0.129 mg/mL)。

2.3.2 苯酚試液配制 取苯酚100 g，加鋁片0.1 g，碳酸氫鈉0.5 g，蒸餾，收集182 ℃時的餾分10 g，加蒸餾水200 mL使溶解，置棕色瓶中，即得。

2.3.3 最大吸收波長測定 精密吸取葡萄糖對照品溶液(0.129 mg/mL)適量，置具塞試管中，加蒸餾水稀釋至2.0 mL，加入苯酚試液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置10 min，置40 ℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫。另取蒸餾水2.0 mL，同法制得空白對照液，于紫外可見分光光度計400～600 nm范圍內(nèi)掃描，其吸收見圖3，從吸收圖可以看出，葡萄糖經(jīng)苯酚-硫酸顯色后，在490 nm有特征吸收峰。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取葡萄糖對照品溶液(0.129 mg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL(葡萄糖對照品含量分別為0.0258、0.0516、0.0774、0.1032和0.1290 mg)，分別加蒸餾水稀釋至2.0 mL，按“2.3.3”項下實驗，采用分光光度法于490 nm波長處測定吸收度，葡萄糖對照品含量和吸收度對應(yīng)關(guān)系見表3。

圖3 葡萄糖對照品紫外掃描譜圖

表3 葡萄糖對照品含量與吸收度對應(yīng)關(guān)系

以葡萄糖含量為縱坐標(biāo)，吸收度為橫坐標(biāo)，用最小二乘法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.151 1X+0.012 3,R2=0.997。線性范圍為：0.025 8～0.129 0 mg。

2.3.5 水提取液中多糖含量測定供試品溶液制備 根據(jù)相關(guān)資料報道，大分子多糖對人體的作用不明顯，而小分子多糖具有較強的生理活性，因此在提取液多糖含量測定中，棄去30%乙醇醇沉的大分子多糖類化合物及部分雜質(zhì)，而對藥理作用更明確的小分子多糖進(jìn)行含量測定。精密吸取正交實驗各提取液2 mL，置10 mL試管中，加60%乙醇2 mL，在渦旋混合器上混合60 s，3 000 r/min離心5 min，取出，仔細(xì)傾取上清液，沉淀中再加30%乙醇2 mL，同上操作，反復(fù)2次，合并上清液，置于10 mL量瓶中，30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2 mL至10 mL試管中，加無水乙醇5 mL，在渦旋混合器上混合60 s，3 000 r/min離心分離5 min，取出，傾棄上清液，沉淀再加無水乙醇5 mL，同上操作，反復(fù)2次，沉淀用水溶解定量轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.6 供試品最大吸收波長測定 精密吸取水提取液總多糖供試品溶液0.2 mL，置10 mL具塞試管中，按“4.3.3”項下實驗。Agilent8453 紫外分光光度計于400～600 nm范圍內(nèi)掃描，其吸收見圖4。從圖4可以看出，供試品溶液吸收圖譜與對照品吸收圖譜基本一致。

圖4 供試液(總多糖)紫外掃描圖譜

2.3.7 穩(wěn)定性考察 精密吸取預(yù)實驗水提取液2 mL，按“2.3.5”項下操作，制備供試品溶液，再按“2.3.3”項下實驗，每隔1 h測定吸收度，測定6次。結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

從上述穩(wěn)定性試驗結(jié)果可以看出，供試液經(jīng)苯酚-硫酸顯色后，供試品溶液在0～2 h內(nèi)穩(wěn)定，因此，供試液顯色后要在2 h內(nèi)測定完成。

2.3.8 重復(fù)性試驗 精密吸取預(yù)實驗水提取液2 mL，平行6份，分別按“2.3.5”項下操作，制備供試品溶液，再按“2.3.3”項下實驗，測定490 nm波長處吸收度，代入曲線方程，計算提取液中總多糖含量。結(jié)果見表5。

表5 多糖含量測定重現(xiàn)性試驗結(jié)果

從上述多糖含量測定重現(xiàn)性試驗結(jié)果可以看出，本含量測定方法重現(xiàn)性良好。

2.4 總皂苷含量測定方法研究

2.4.1 人參皂苷Rg1對照品溶液制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的人參皂苷Rg1對照品11.6 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(濃度為2.32 mg/mL)。

2.4.2 1%香草醛-高氯酸溶液制備 稱取香草醛1.0 g，加高氯酸100 mL使溶解，置棕色瓶中保存。

2.4.3 人參皂苷Rg1對照品顯色溶液最大吸收波長測定 精密吸取人參皂苷Rg1對照品溶液(2.32 mg/mL)50 μL，置具塞試管中，于水浴上揮干甲醇，加入1%香草醛-高氯酸溶液0.5 mL，搖勻，60 ℃水浴保溫15 min，取出，流水冷卻5 min，加入5.0 mL冰醋酸，渦旋混勻。另取甲醇0.5 mL，同法制得空白對照液，紫外可見分光光度計于400～800 nm范圍內(nèi)掃描，其吸收圖見圖5，從紫外吸收圖可以看出，人參皂苷Rg1經(jīng)香草醛-高氯酸顯色后，在544 nm有特征吸收峰。

2.4.4 人參皂苷Rg1對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取人參皂苷Rg1對照品溶液(2.32 mg/mL)20、30、40、50、70和90 μL，按“4.4.3”項下實驗，采用分光光度法于544 nm波長處測定吸收度，吸收度和人參皂苷Rg1對照品含量對應(yīng)關(guān)系見表6。

圖5 人參皂苷Rg1對照品紫外掃描圖譜

以吸收度為橫坐標(biāo)，人參皂苷Rg1含量為縱坐標(biāo)，用最小二乘法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為：Y=0.237X+0.000 2,R2=0.996，線性范圍：0.046 4～0.208 8 μg。

2.4.5 提取液中總皂苷含量測定供試品溶液的制備 按水提取液黃芪甲苷供試品溶液制備方法制備總皂苷供試品溶液。

表6 人參皂苷Rg1對照品含量與吸收度對應(yīng)關(guān)系

2.4.6 供試品顯色溶液最大吸收波長測定 精密吸取供試品溶液0.2 mL，置10 mL具塞試管中，按“2.4.3”項下實驗。紫外分光光度計于400～800 nm掃描，其吸收圖譜見圖6，從圖6可以看出，供試品溶液吸收圖譜與對照品吸收圖譜最大吸收波長基本一致。

圖6 供試液(總皂苷)紫外掃描圖譜

2.4.7 供試品顯色溶液穩(wěn)定性考察 精密吸取預(yù)實驗提取液，按“2.4.5”項下制得供試品溶液，再按“2.4.3”項下實驗，每隔1 h測定吸收度，測定6次。結(jié)果見表7。

表7 總皂苷供試品溶液顯色穩(wěn)定性試驗結(jié)果

從上述穩(wěn)定性試驗結(jié)果可以看出，供試液經(jīng)香草醛-高氯酸顯色后，樣品溶液在0～2 h內(nèi)穩(wěn)定，因此，供試液顯色后要在2 h內(nèi)測定完成。

2.4.8 總皂苷含量測定方法重現(xiàn)性實驗 精密吸取預(yù)實驗提取液25 mL，共計6份，分別按“2.4.5”項下平行實驗，制備出供試品溶液，再按“2.4.3”項下實驗，測定544 nm波長處吸收度。試驗結(jié)果見表8。

從上述總皂苷含量測定試驗結(jié)果可以看出，本含量測定方法重現(xiàn)性良好。

2.5 提取工藝優(yōu)選

2.5.1 正交試驗因素水平確定 依據(jù)水提取常規(guī)，選擇對提取效果有影響的加水量、提取時間、藥材浸泡時間、提取次數(shù)為考察因素，每個因素選擇3個常規(guī)水平，按L9(3)4正交表進(jìn)行試驗設(shè)計。正交試驗因素水平見表9。

表8 重現(xiàn)性試驗結(jié)果

表9 水提取正交實驗因素水平

2.5.2 正交試驗方法及實驗安排表 按處方配比，分別取黃芪、麥冬、紅參、茯苓、甘草、法半夏、烏梅等13味藥材，共計18份，分別混勻，每份總生藥量560 g。按表L9(3)4正交試驗安排表，進(jìn)行水提取正交試驗，提取液濾過，合并濾液，分別測定各次試驗水提取液中黃芪甲苷、總多糖、總有機酸、總皂苷含量。含量測定結(jié)果見表10。

表10 各成分含量測定結(jié)果

2.6 試驗結(jié)果分析

表11 歸一化處理矩陣

(2)最優(yōu)方案與最劣方案。根據(jù)歸一化理后的矩陣得到最優(yōu)值和最劣值向量，最優(yōu)方案：Z+=(0.357 4，0.087 1，0.185 3，0.005 0)；最劣方案：Z-=(0.314 9，0.077 1，0.099 5，0.003 9)。

第i個評價對象與最優(yōu)方案的貼近度Ci(值越大綜合效益越好)為：

2.6.2 不同工藝貼近度分析 對化胃舒水提取黃芪甲苷收率、總有機酸含量、總多糖含量及總皂苷含量多工藝目標(biāo)綜合分析，分析結(jié)果見表13。

表12 試驗方案的歐氏距離和貼近度

表13 工藝參數(shù)各水平綜合平均貼近度

結(jié)果表明，對水提取工藝影響因素數(shù)排序為A>B>D>C，即加水倍數(shù)和提取時間的影響較大，浸泡時間和提取次數(shù)影響較小，最佳提取參數(shù)為A1B3C2D1。

2.7 工藝驗證

參為驗證工藝的穩(wěn)定性，用最佳提取工藝進(jìn)行3批驗證試驗，結(jié)果見表14。結(jié)果顯示3批樣品的黃芪甲苷收率、總有機酸、總多糖、總皂苷的平均值分別為91.27%、23.48 g、40.69 g、1.35 g，其RSD分別為1.2%、1.2%、1.8%、2.7%，表明工藝穩(wěn)定可行。

表14 驗證試驗結(jié)果

3 討論

目前，測定植物中多糖含量主要是利用多糖在濃硫酸作用下迅速脫水成糠醛或羥甲基糠醛，再由酚類、芳胺類等檢測劑與之反應(yīng)，生成具有特定顏色的有機化合物，在一定范圍內(nèi)，溶液顏色的深淺與糖的含量成正比[13]。根據(jù)顯色劑的不同，已知顯色方法有苯酚-硫酸法[14-15]、蒽酮-硫酸法[16-17]、咔唑-硫酸法[18]等。苯酚-硫酸比色法主要用于甲基化的糖、戊糖、寡糖類以及多聚糖的測定，甚至可以用于糖肽和糖蛋白的測定。此法優(yōu)勢在于可以進(jìn)行大量樣品的測定，實驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，且產(chǎn)生的有色化合物在120 min內(nèi)顏色穩(wěn)定，因此選擇苯酚-硫酸法用于總多糖含量測定。

烏梅及處方中其他藥材所含有機酸具有調(diào)理胃腸蠕動、促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎組織細(xì)胞再生、修復(fù)胃黏膜損害、促進(jìn)胃酸分泌等作用，因此在制備工藝研究中擬對水提取液中總有機酸含量進(jìn)行測定。現(xiàn)階段中藥提取液中總有機酸含量測定方法主要有化學(xué)滴定法及電位滴定法。由于中藥提取液顏色深，嚴(yán)重干擾化學(xué)滴定法滴定終點判斷，因此選擇電位滴定法測定水提取液中總有機酸含量。

目前中藥提取液中總皂苷含量測定方法主要有重量法及紫外-可見分光光度法，由于復(fù)方中含皂甙類化合物藥材多，重量法測定實驗誤差較大，因此本制劑工藝研究水提取液中總皂苷含量測定方法擬首選紫外-可見分光光度法。

TOPSIS通過將多指標(biāo)計算為一個綜合指標(biāo)，克服人為確定權(quán)重系數(shù)的片面性及主觀性，提高分析方法的可靠性，該方法已應(yīng)用到多種中藥質(zhì)量評價。如姚入宇等[19]、陳家儀等[20]、李運等[21]、羅益遠(yuǎn)等[22]，分別采用Topsis法對北柴胡種子、猴耳環(huán)、三七、桔梗藥材的質(zhì)量進(jìn)行了評價；劉書斌等[23]基于AHP法優(yōu)化的熵權(quán)TOPSIS模型對不同產(chǎn)地黃花菜藥材質(zhì)量的進(jìn)行了綜合評價；馬天翔等[24]基于OPLS結(jié)合熵權(quán)TOPSIS法對不同產(chǎn)地鎖陽進(jìn)行了鑒別與綜合質(zhì)量評價；嚴(yán)倩茹等[25]、張娜等[26]將TOPSIS與灰色關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合分別對維C銀翹片及不同產(chǎn)地廣西郁金的質(zhì)量進(jìn)行了評價。本研究通過測定化胃舒水提取液中黃芪甲苷收率、總有機酸含量、總多糖含量、總皂苷含量，與 TOPSIS綜合評價法相結(jié)合，計算不同提取條件的化胃舒水提取液各指標(biāo)成分的綜合評價數(shù)值，其結(jié)果更具有客觀性和科學(xué)性，最終優(yōu)選出化胃舒顆粒水提取的最佳工藝條件，即浸泡2 h，加水提取2次，每次加水10倍量，提取2 h。