周海倫，操家順，3，羅景陽，3，孫藝雯

(1.河海大學 淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室，江蘇 南京 210098；2.河海大學 環(huán)境學院，江蘇 南京 210098；3.國河環(huán)境研究院(南京)有限公司，江蘇 南京 211599)

隨著中國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，預計2030 年畜禽糞便產(chǎn)量將達到37.43億t。將畜禽糞便進行肥料化利用既可以解決畜禽糞便污染，又可以回收N、P、K資源[1]，但糞肥的施用也會導致殘存的抗生素進入土壤[2-3]，對土壤生態(tài)造成危害。已有研究主要探討?zhàn)B殖場周邊[4]、糞肥施用后的土壤中抗生素含量[5]，但有機肥中抗生素殘留情況研究較少。

本文參照《食品安全國家標準——食品中獸藥最大殘留量》(GB 31650—2019)標準，選取了30種在動物體內(nèi)殘留量較高的抗生素進行檢測。

以湖北省某畜禽糞污處理中心為例，檢測了厭氧發(fā)酵、好氧堆肥、干化炭化工藝制備的三種商用有機肥料，分析其抗生素污染特征，并進行生態(tài)風險評估，為后續(xù)的還田利用提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

30種抗生素標準品(包括4種四環(huán)素類(TCs)：Doxycycline(DOC)，Tetracycline(TC)，Oxytetracycline(OTC)，Chlortetracycline(CTC)；5種大環(huán)內(nèi)酯類(MLs)：Lincomycin(LIN)，Roxithromycin(RTM)，Azithromycin(AZI)，Erythromycin(ETM)，Tylosin tartrate(TYL)；8種磺胺類(SAs)：Trimethoprim(TMP)，Sulfamonomethoxine(SMM)，Sulfamethoxaz(SMT)，Sulfaquinoxaline(SQX)，Sulfamethazine(SMZ)，Sulfacetamide(STM)，Sulfadimethoxine(SMX)，Sulfadiazine(SDZ)；7種氟喹諾酮類(FQs)：Ofloxacin(OFC)，Norfloxacin(NFC)，Ciprofloxacin(CIP)，Difloxacin(INN)；4種抗真菌類(β-lactams)：Miconazole(MCZ)，N4-Acetyl-Sulfamethoxazole(NAST)，Ketoconazole(KTC)，F(xiàn)luconazole(FLE)；2種氯霉素類(CAPs)：Thiamphenicol(TAP)，Sulfathiazole(ST))均購于中國阿拉丁公司；甲酸、乙腈、氫氧化銨均為色譜純；甲醇、檸檬酸、丙酮、NaH2PO4、Na2EDTA、NaOH均為分析純。

ACQUITY UPLC Xevo TQ型高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(配備ACQUITY BEH C18色譜柱)；AUTOTRACE 280型固相萃取儀(配備HLB固相萃取柱)；MZY-UCR10V型超純水儀；SX2-4-10Z型烘干機；XZ-16T型臺式離心機；ALPHA1-2LD PLUS型凍干機；SCILOGEX MX-S型旋渦混勻器；SCQ-6201C型超聲波清洗機等。

1.2 樣品采集

樣品采自湖北省某畜禽糞便資源化處理中心，所處理糞污覆蓋7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的規(guī)?；B(yǎng)殖場共計 102萬頭生豬、500萬羽家禽、6萬頭牛，總計年產(chǎn)150萬t。資源化處理中心的畜禽糞污全量化利用制備有機肥的方式為好氧處理、干化炭化、厭氧發(fā)酵三種，可分別制備有機肥、炭基肥、液肥三種商用有機肥料。樣品按固態(tài)和液態(tài)分類采集，每個取樣點重復取樣3次，每次取樣200 mL，混合后，分為2份平行樣本，共計36個樣品(24個固態(tài)樣品，12個液態(tài)樣品)，所有樣品取樣后-4 ℃保存[6-7]。

圖1 畜禽糞污處理流程和取樣點Fig.1 Treatment processes of livestock manureand sampling points

1.3 分析方法

1.3.1 樣品處理 固體樣品經(jīng)凍干機冷凍干燥，研磨后過40目篩網(wǎng)。分別稱取1 g糞便樣品，用 10 mL 檸檬酸酸化、乙腈提取，在漩渦混勻器上 2 500 r/min 混勻10 s，25 ℃超聲15 min，然后在 4 ℃，4 500 r/min條件下離心15 min，重復提取 1次，收集上清液，通過聚四氟乙烯過濾膜，氮氣吹近干，用100 mL超純水稀釋，通過0.7 μm玻璃纖維過濾膜，待進入固相萃取儀。液體樣品離心后(9 000 r/min，3 min)取上清液5 mL，用甲酸/乙腈初始流動相稀釋200～500倍，過0.22 μm親水性玻璃纖維膜后保留濾液，無需萃取，置于-4 ℃避光保存，以待上機。

1.3.2 色譜條件和質(zhì)譜條件 所有樣品均采用電噴霧正離子(ESI+)和電噴霧負離子模式(ESI-)下操作的Water LC-MS/MS進行分析。每個樣品進樣量為5 μL。流動相為氫氧化銨(溶劑A)和乙腈(溶劑B)，流速為200 μL/min。濃度梯度(時間(min)，A%和B%曲線)的程序如下：(0，90/10)，(0.25，90/10)，(3，10/90)，(4，10/90)，(4.01，90/10)和(5，90/10)。其他色譜和質(zhì)譜參數(shù)參考已有文獻[8-9]，毛細管電壓保持在3 000 V。

1.3.3 回收率實驗 在1 g干燥的空白樣品中，分別添加5 μg/L的四環(huán)素類抗生素混合標準溶液20，100，400 μL，對應的添加濃度分別為0.1，0.5，2 mg/kg，混勻穩(wěn)定10 min后，后續(xù)步驟與預處理步驟相同，上機測定[10]。每個加標濃度水平各平行3次實驗進行測定，經(jīng)計算本次實驗加標樣品中目標抗生素的回收率為65.4%～105.9%，標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.997。

1.4 生態(tài)風險評估

1.4.1 生態(tài)風險評估方法 風險商值法(RQ)是環(huán)境中污染物生態(tài)風險評估的主要方法之一，已被廣泛用于評估土壤環(huán)境中抗生素潛在生態(tài)風險的大小。抗生素的RQ值由下式計算：

RQ=MEC/PNEC

(1)

式中，MEC為土壤中預測的抗生素濃度；PNEC為抗生素抗性選擇的預測無影響濃度，根據(jù)RQ值可以分為3個污染等級：0.01≤RQ<0.1，為低風險；0.1≤RQ<1，為中風險；RQ≥1，為高風險[11]?？股氐亩纠硇詳?shù)據(jù)可直接在美國環(huán)保署EPA ECTOX數(shù)據(jù)庫中查找，土壤的毒理性數(shù)據(jù)缺失時使用淡水中數(shù)據(jù)和水-土壤分配系數(shù)進行折算[12-13]。計算方法如下：

PNECwater=EC50/AF

(2)

PNECsoil=PNECwater×Kdsoil

(3)

式中PNECwater——淡水中抗生素抗性選擇的無效應濃度，μg/L；

PNECsoil——土壤中抗生素抗性選擇的無效應濃度，μg/kg；

Kdsoil——土壤-水的分配系數(shù)，L/kg，為了最大化估計土壤中抗生素的影響，選擇現(xiàn)有研究中土壤類型相近的最低PNECsoil進行估計[14]；

EC50——急性毒性參考因子，半最大效應濃度，mg/L；

AF——評估因子，考慮到目標抗生素毒性數(shù)據(jù)都具有短期試驗，故AF取值1 000[15]。

1.4.2 抗生素濃度計算方法 糞便中的抗生素向土壤遷移的過程十分復雜[16]，故本研究在已知三種有機肥料抗生素濃度的基礎(chǔ)上，按照歐盟公布的評估獸藥環(huán)境風險的新指南(VM)適當調(diào)整后，對有機肥施用后的土壤中抗生素濃度進行預測。首先按作物生長需求量計算可施用于土地的最大肥量[17]，其次檢測出有機肥中抗生素濃度，再計算施用有機肥后犁過的土壤中抗生素濃度[18]。為了以最壞情況計算，預測濃度不考慮隨氣候變化、農(nóng)業(yè)活動導致的部分抗生素降解或遷移，將犁過土壤中抗生素濃度作為MEC值代入式(1)進行生態(tài)風險商值的計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 畜禽糞便初始抗生素殘留情況

6大類30種抗生素的檢測結(jié)果見表1。

表1 樣品中抗生素檢出率及濃度均值Table 1 Detection types and average concentrations of antibiotics in samples

由表1可知，采集的樣本中，6大類抗生素均有效檢出。在未經(jīng)處理的糞污中共檢出抗生素19種，檢出種類以四環(huán)素類TCs、喹諾酮類FQs、大環(huán)內(nèi)酯類MLs及磺胺類SAs為主，四大類抗生素ΣTCs、ΣFQs、ΣMLs、ΣSAs濃度均值分別為 1 472.91，28.62，1.87，3.3 μg/kg(干基)，與胡獻剛等檢測的豬糞中各類抗生素相比四環(huán)素類的平均濃度偏高[8]，土霉素最高值達3 626.9 μg/kg(干基)。檢出濃度最高的4種畜禽糞便中的抗生素分別為土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素，皆屬四環(huán)素類(濃度≥450 μg/kg(干基))。

4種四環(huán)素類抗生素強力霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素在12份固態(tài)樣品中檢出率皆為100%，喹諾酮類抗生素檢出種類最多，共檢出7種，按檢出率高低，分別為氧氟沙星=諾氟沙星=恩諾沙星>洛美沙星>氟羅沙星>環(huán)丙沙星>雙氟沙星。檢出率越高，代表該抗生素在糞便處理過程中的持久性越強，越不易降解。

大環(huán)內(nèi)酯類有效檢出林可霉素、羅紅霉素和阿奇霉素3種，抗真菌類和氯霉素類各有效檢出一種分別為咪康唑和甲砜霉素，以上三類抗生素中濃度最高的僅為3.3 μg/kg(干基)，可見不同種類的抗生素殘留濃度之間存在著超過3個數(shù)量級的差距，可能原因：一是抗生素在動物體內(nèi)的代謝程度不同而導致排出體外的抗生素殘余量差異較大；二是在畜禽養(yǎng)殖過程中不同抗生素的使用量會根據(jù)生長周期、季節(jié)的變化而有所波動。

2.2 固態(tài)有機肥抗生素殘留情況

固態(tài)糞便資源化方式分為好氧堆肥處理和干化炭化處理，分別制備有機肥(CP)和炭基肥(CBOF)，各工藝階段抗生素殘留情況見圖2。

圖2 四類主要檢出抗生素在好氧堆肥和干化炭化過程中的濃度變化Fig.2 Concentration changes of major detected antibioticsduring composting and carbonizationa.四環(huán)素類(TCs)；b.喹諾酮類(FQs)；c.大環(huán)內(nèi)酯類(MLs)；d.磺胺類(SAs)

由圖2可知，有機固態(tài)肥料制備過程中各類抗生素總量呈波動式下降趨勢，脫水及固液分離環(huán)節(jié)對固態(tài)畜禽糞便中的TCs去除率為21.6%～57.4%，對FQs去除率達94.0%～96.4%。經(jīng)過預處理后，固態(tài)糞污分為堆肥和炭化兩種處理方式，分別制備CP和CBOF。為調(diào)節(jié)水分含量，畜禽糞便在堆肥和炭化前與木屑等物料進行混合。除MLs外，所有抗生素濃度都因水分的極速變化而迅速降低30%～68%。

堆肥處理后，抗生素種類由19種減至8種，四類主要抗生素ΣTCs、ΣFQs、ΣMLs、ΣSAs濃度平均值分別為47.28，2.73，6.25，0.38 μg/kg(干基)，OTC濃度依然最高，為285.15 μg/kg(干基)。除了SMM和TMP去除率不足90%，其余抗生素去除率普遍達95%。堆肥處理對四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素的去除效果較好，去除率為90%～95%，因為TCs和FQs對生物降解十分敏感。但MLs和SAs經(jīng)過預處理后濃度升高，這是由于固液分離后的糞污總量大大減少，導致抗生素在固相中的富集。堆肥中的MLs和SAs在處理前后出現(xiàn)的負去除情況可能是由于處理周期較長，進料與出料非同一批次糞污，原料抗生素濃度本就有差異，故檢測結(jié)果作為糞污和有機肥中殘留的抗生素定性研究有較高參考價值，若作為定量研究需要進一步取樣測試。

干化炭化對喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類抗生素幾乎100%去除，殘留的抗生素濃度總殘留量小于1 mg/kg，但對四環(huán)素類抗生素去除率僅為72%～88%。與堆肥處理相比，干化炭化對抗生素的總?cè)コ矢?0%～30%，主要原因是絕大部分抗生素都有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和羰基、羥基和氨基等活潑基團，不具備熱穩(wěn)定性。堆肥溫度最高在70～80 ℃，而炭化爐中溫度為400 ℃，持續(xù)高溫加熱使抗生素的分子結(jié)構(gòu)或基團更易被破壞。

2.3 液態(tài)有機肥抗生素殘留情況

由圖3可知，液肥(LOF)處理過程中，厭氧池對四環(huán)素、土霉素的去除效果較好，但對林可霉素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星的去除率皆低于15%，對金霉素出現(xiàn)了負去除的情況；而初沉池對各類抗生素的去除效果不佳，多數(shù)出現(xiàn)了負去除，原因可能是液肥在沉淀池中最長停留30 d，有一定的濃度富集情況。

圖3 液肥處理過程中主要抗生素濃度Fig.3 Concentration changes of major detected antibioticsduring the liquid organic fertilizer

液態(tài)畜禽糞便處理前檢測出的初始抗生素為8種，不足糞便原料抗生素種類的1/2，與固態(tài)畜禽糞便相比TCs未檢出強力霉素，F(xiàn)Qs未檢出氟羅沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星；MLs未檢出羅紅霉素、阿奇霉素；SAs未檢測出磺胺二甲基嘧啶和甲氧芐啶。雖然這些抗生素都具有水解穩(wěn)定性，但對固態(tài)糞便表現(xiàn)出更強的吸附親和力，故在液態(tài)糞便中未能達到檢出限。處理后的液肥中仍包含3中抗生素殘留，殘留濃度最高的依然是金霉素和林可霉素，濃度分別為341.86，147.12 mg/L，占液肥殘留抗生素總量的98%。金霉素和林可霉素在豬的保育、育成育肥、哺乳、妊娠階段的呼吸道、軟組織感染的預防和治療都有大量使用；特別是林可霉素使用量在中國獸用藥中排名第三，除此之外這兩種抗生素在鹽溶液中的溶解性強且不易發(fā)生水解，在水中具有持久性，是液肥后續(xù)處理中需要關(guān)注的主要目標。

2.4 三種有機肥處理過程中抗生素殘留情況的比較

三種有機肥處理過程中抗生素殘留濃度和去除率見表2。

表2 三種有機肥中抗生素的殘留濃度和去除率Table 2 Residue concentration and removal rate of antibiotics in three kinds of org-fertilizer

由表2可知，三種有機肥中每一種高殘留抗生素都是四環(huán)素類，尤其是OTC，這也是糞便樣品中檢測到的最高濃度，顯示了畜禽飼養(yǎng)過程中四環(huán)素類的使用范圍廣、用量大。除OTC的殘留水平高于其他研究外[19]，TC和CTC的殘留水平與其他研究中大致相同。

在本研究中，堆肥、炭化和厭氧處理對抗生素有不同的去除機理，三種處理的平均去除率分別為 86.85%，96.35%和61.38%，抗生素殘留濃度為畜禽糞便(1.87～1 472.91 μg/kg干重)>LOF(147.12～341.86 mg/L)>CP(0.38～47.27 μg/kg干重)>CBOF(0.05～1.41 μg/kg干重)。由此可知：①TCs是堆肥、炭基肥和液肥的主要殘留抗生素；②TCs、FQs和SAs更容易留在固相中，脫水處理是去除糞便固體部分TCs和FQs的決定性因素；③高濃度殘留代表該類抗生素在動物養(yǎng)殖過程中的使用較多，且處理過程不易降解。

2.5 有機肥料農(nóng)用的生態(tài)風險評估

以農(nóng)業(yè)部公布的《畜禽糞污土地承載力測算技術(shù)指南》中關(guān)于區(qū)域植物養(yǎng)分需求量和豬當量糞肥養(yǎng)分供給量作為參考依據(jù)，在美國環(huán)保署EPA ECTOX數(shù)據(jù)庫中查找相關(guān)毒理學數(shù)據(jù)(表3)，并計算得出三種有機肥殘留濃度的風險熵值見圖4。

由圖4可知，炭基肥和堆肥中所有抗生素的風險可接受，熵值<0.1；液肥中金霉素具有中風險，其次林可霉素風險較高，達0.04，液態(tài)肥料的安全性低于固態(tài)肥料，其農(nóng)用的潛在風險更大。然而，就有機肥施用的特點來看，此處的結(jié)果為肥料施用后到達淺層土壤的即時濃度，濃度水平為mg/kg級。隨著時間的遷移和降雨影響，土壤中抗生素濃度會進一步下降，生態(tài)風險也隨之降低。除此之外，抗生素對植物、土壤動物與微生物的毒理效應還受土壤的理化性質(zhì)等影響[20]。雖然有機肥中的抗生素向土壤環(huán)境中遷移量有限[21]，但考慮到抗生素的降解周期長，代謝產(chǎn)物同樣具有毒性的特點，長時間的有機肥施用仍需要慎重考慮。

表3 檢出抗生素急性毒性數(shù)據(jù)及土壤分配系數(shù)Table 3 Acute toxicity data and soil distribution coefficient of antibiotics detected

圖4 三種有機肥中抗生素生態(tài)風險熵值

3 結(jié)論

在好氧堆肥、干化炭化、厭氧發(fā)酵三種方式制備的有機肥、炭基材料、液肥中，抗生素殘留含量最高的分別為土霉素285.15 μg/kg(干基)、環(huán)丙沙星 2.38 μg/kg(干基)、金霉素341.86 mg/L，就去除率而言，炭化處理>好氧堆肥>厭氧發(fā)酵。

急性毒理學數(shù)據(jù)表明，三種有機肥料中抗生素對土壤環(huán)境的危害：液肥>堆肥>炭基肥，這與三種肥料制備工藝對抗生素去除效果一致，故抗生素殘留濃度與其對應的生態(tài)風險具有正相關(guān)性?？股卦谕寥乐械亩纠硇詳?shù)據(jù)仍有較多的缺失，毒性數(shù)據(jù)多來源于水生植物或動物，對各類農(nóng)作物種子及幼苗的毒性仍不明晰，需要進一步探究。