冀玉良，趙志新，高寶云

（商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院/商洛市秦嶺植物良種繁育中心，陜西商洛 726000）

隨著中藥材需求量不斷上升，僅靠自然生長的中藥材資源已不能滿足人們需要，為了解決中藥材供需矛盾，當前對中藥材普遍進行人工栽培。但是人工栽培中藥材一直面臨著容易導致土壤有害微生物富集、病蟲害發(fā)生加劇、植物自毒物質積累和土壤肥力下降等連作障礙問題[1-3]。近十幾年來，在克服連作障礙研究方面，基于微生物菌劑或有機肥的土壤改良方法倍受人們重視[4-7]。由于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有典型的芽孢桿菌的特征，并具有生長迅速、抗逆性強、適應范圍廣等優(yōu)點，它不僅能分泌多種抗菌物質，對各種病原菌，特別是對引起植物根腐病、枯萎病等病害的尖孢鐮刀菌有較好的抑制作用，而且還具有較強的解磷、分泌植物生長素能力，對作物生長有一定的促進作用，因此枯草芽孢桿菌在連作障礙土壤改良修復中具有較大的優(yōu)勢和開發(fā)潛力[8-10]。諸多研究表明，枯草芽孢桿菌對設施蔬菜連作障礙土壤的修復作用是通過降低連作障礙土壤中的植物病原菌——尖孢鐮刀菌的數(shù)量，提高土壤中細菌和放線菌的數(shù)量，降低總真菌的數(shù)量，調整土壤的微生物區(qū)系結構和土壤中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶等的活性來實現(xiàn)的[11-13]。向黃瓜、西瓜和獼猴桃連作障礙土壤中施入不同劑量的枯草芽孢桿菌可緩解協(xié)迫條件下幼苗受到的傷害，提高果實的品質[14-16]。枯草芽孢桿菌對玉米、小麥和大豆等糧食作物連作中的促生作用也主要是通過提高其組織中過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高作物對土傳病原菌的抵抗能力和各種抗脅迫能力，使其免受侵害[17-19]。

枯草芽孢桿菌PS-8是本課題組從桔梗組織中分離獲得的一株內生菌，前期抑菌試驗研究表明，枯草芽孢桿菌PS-8對煙草赤星病菌、蘋果炭疽病菌、茄病鐮孢霉和西瓜枯萎病菌等均有一定的抑制作用。本研究采用室內盆栽法向桔梗連作土壤中添加不同比例的枯草芽孢桿菌PS-8菌劑，分析其對土壤微生物群落、土壤酶活性的影響，以及對桔梗幼苗的促生作用，進一步探明用枯草芽孢桿菌PS-8制作桔梗連作障礙土壤改良劑的可行性，為其應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌PS-8（從商州區(qū)沙河子鎮(zhèn)農戶桔梗種植地采集的桔梗植株組織中分離，通過革蘭氏染色和分子測序比對等鑒定其為枯草芽孢桿菌，保存于商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院微生物學實驗室）、尖孢鐮刀菌（購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）、桔梗種子（由陜西天士力植物藥業(yè)商洛有限責任公司提供）、供試土壤（桔梗連作多年的土壤，采自商州區(qū)沙河子鎮(zhèn)農戶桔梗種植地）。

1.2 培養(yǎng)基

細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)；真菌用馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)；放線菌用高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)。以上培養(yǎng)基配方參考文獻[20]。

尖孢鐮刀菌用改良的KOM-ADA選擇培養(yǎng)基：K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，EDTA（C10H16N2O8）100 mg，L-天門冬酰胺 2 g，D-半乳糖10 g，瓊脂16 g，滅菌水900 mL，120 ℃滅菌 15 min。

培養(yǎng)基冷卻到50℃時添加以下培養(yǎng)液：Na2B4O71 g，PCNB（五氯硝基苯） 1 g，牛膽鹽500 mg，鏈霉素 300 mg，氯霉素 100 mg，10%磷酸調節(jié)至pH為4。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌PS-8活化與菌劑制備

枯草芽孢桿菌PS-8接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上活化24 h后，轉接入LB液體培養(yǎng)基，于 220 r/min，30 ℃下培養(yǎng) 35～40 h，顯微鏡檢有90%形成芽孢時收集菌液，經10 000 r/min離心濃縮，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，將濃縮液稀釋成2×108cfu/mL的接種菌液，保存于4℃冰箱，備用。

1.3.2 桔梗催芽與移栽

選取大小均勻、健康的桔梗種子，用3%KMnO4浸泡30 min，蒸餾水沖洗6次，自然晾干。在洗凈烘干的直徑9 cm的培養(yǎng)皿中鋪上雙層濾紙，加入10 mL蒸餾水浸濕濾紙后，將桔梗種子置于其上，每皿50粒，放入25℃，85.5%濕度人工氣候箱中培養(yǎng),每天補加蒸餾水保持濾紙濕潤。待桔梗幼苗生長至大約2 cm時，選用長勢一致的桔梗種苗，移栽至裝有桔梗連作土壤，直徑15 cm、高15 cm的塑料小盆中。每盆裝土500 g，設4個處理，各處理按重量比分別往土壤中加入1%，2%，3%，4%的枯草芽孢桿菌PS-8菌劑并與土壤充分混合，以蒸餾水代替菌劑作對照（CK），每處理3盆，重復4組共60盆。移栽好的桔梗盆栽苗移至人工氣候室,按常規(guī)進行生長管理。

1.3.3 土壤微生物數(shù)量測定

分別于桔梗盆栽苗生長14，28，42，56 d時，按對角線五點法從每個塑料盆中選5個采樣點，在表層下5 cm取土壤樣品并混勻，去除雜質，用四分法留取土樣，土樣于遮光、低溫下放置，并及時測定土壤中尖孢鐮刀菌、細菌、放線菌和總真菌（總真菌中包括尖孢鐮刀菌）數(shù)量。

土壤微生物數(shù)量測定采用稀釋涂布平板法，參考文獻[11,20]的方法。尖孢鐮刀菌計數(shù)吸取10-2土壤稀釋液，對應涂布于改良的 Komada選擇性培養(yǎng)基；細菌計數(shù)吸取10-6土壤稀釋液，對應涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（為抑制霉菌生長其中加入終濃度為5 μg/mL的制霉菌素溶液）；總真菌計數(shù)時吸取10-3土壤稀釋液，對應涂布于馬丁氏孟加拉紅選擇性培養(yǎng)基（為抑制細菌和放線菌的生長，在1 000 mL培養(yǎng)基中加入1%孟加拉紅3.3 mL，鏈霉素加熱易分解，臨用前按每100 mL培養(yǎng)基中加入1%鏈霉素0.3 mL）；放線菌計數(shù)吸取10-4土壤稀釋液，對應涂布于高氏培養(yǎng)基。

1.3.4 土壤酶活性測定

土壤酶活性測定參考文獻[12-14]的方法。過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定，結果以每克土消耗0.1 mol/L KMnO4的毫升數(shù)表示（mL/g）；土壤脲酶活性采用靛酚藍比色法測定，以每克土24h產生的NH3-N毫克數(shù)表示（mg/g）；蔗糖酶活性采用二硝基水楊酸比色法測定，以每克土24 h產生的葡萄糖毫克數(shù)表示；磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，以每克土24 h產生的酚毫克數(shù)表示。所有測定重復3次取平均。

1.3.5 桔梗葉片MDA含量測定

分別于桔梗盆栽苗生長 14，28，42，56 d 時進行植株葉片取樣（56 d時等桔梗幼苗株高、鮮重測定后再取樣），每處理從上往下數(shù)取5片葉片，葉片沖洗干凈，晾干稱重后用研缽冰浴研磨，用于測定MDA含量。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法,利用MDA在高溫、酸性條件下與硫代巴比妥酸（TBA）反應，生成的有色三甲基復合物在波長532 nm處有最大光吸收來測定，含量以每克葉片含MDA的μmol數(shù)表示，測3次取平均值。

1.3.6 桔梗生長量測定

分別于桔梗盆栽苗生長14，28，42，56 d時用米尺測株高，并于桔梗盆栽苗生長56 d時，進行破壞性取樣，小心從花盆中取出植株，輕輕抖去土粒，清水沖洗凈并用吸水紙吸干水分，分別用米尺和百分天平測定桔梗幼苗株高和鮮重。

1.3.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，各處理間的差異顯著性檢驗采用Duncan's多重比較法。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗根際土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

桔梗種植多年后的土壤中引起根腐病的尖孢鐮刀菌數(shù)量會大量增加，進一步導致連作障礙。由圖1可知，在施入枯草芽孢桿菌PS-8前測得土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量為16.74×102cfu/g，施入枯草芽孢桿菌后14，28，42，56 d時各處理的尖孢鐮刀菌數(shù)量都明顯低于施入前的數(shù)量，其中至28 d時，1%，2%，3%，4%各菌劑處理的尖孢鐮刀菌數(shù)量分別為 10.16×105，4.28×102， 8.61×102，10.37×102cfu/g，與施入前相比分別下降了39.31%，74.43%，48.57%，38.05%，可見2%菌劑處理在28 d時下降最多。在同一時期，各處理的尖孢鐮刀菌數(shù)量與對照之間達到極顯著差異（P<0.01），其中2%菌劑處理的尖孢鐮刀菌數(shù)量最低，且與同期1%，3%，4%各菌劑處理之間相比差異也達到顯著水平（P<0.05）。另外，從圖1中也可以看出，從0～14 d，對照土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量上升，隨后開始有所下降，這與徐彬等[11]用枯草芽孢桿菌1013對連作障礙土壤的改良及對番茄的促生作用的研究結果基本一致。分析原因可能是連作土壤中病原菌的繁殖也有周期性的階段變化，過了高峰就會有所下降，但病原菌不會在土壤中自然消除，進入下一個繁殖周期又可能會到達一個高峰，而從枯草芽孢桿菌PS-8加入至14 d和28 d時土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量與對照相比大幅下降的結果正好證明加入菌劑的生防效應是極顯著的。

圖1 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗根際土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

2.2 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗根際細菌數(shù)量的影響

桔梗連作多年土壤中微生態(tài)結構發(fā)生失調，也表現(xiàn)為細菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增加，結果導致土壤的營養(yǎng)下降和病蟲害更易發(fā)生。在施入枯草芽孢桿菌PS-8前測得桔梗連作土壤中細菌數(shù)量為53.62×106cfu/g，由圖2可知，隨著時間的延長，對照土壤中的細菌數(shù)量一直呈現(xiàn)下降趨勢，這正是桔梗連作土壤中微生態(tài)失調，引起細菌數(shù)量減少的表現(xiàn)。接入枯草芽孢桿菌PS-8后0～14 d，各處理土壤的細菌數(shù)量也有所減少，這可能是枯草芽孢桿菌開始在土壤中要經過一個調整適應階段。但從14 d以后各處理土壤的細菌數(shù)量就開始上升，至24，42，56 d時，1%，2%，3%，4%各菌劑量處理的土壤細菌數(shù)量均大于同期對照，且與對照差異達到極顯著水平（P<0.01），其中至28 d時，各處理的細菌到達最大，對應1%，2%，3%，4%各菌劑處理的土壤，細菌數(shù)量分別為 68.31×106，78.61×106，72.63×106，64.75×106cfu/g，與施入枯草芽孢桿菌PS-8前土壤相比，細菌數(shù)量增長率分別為27.40%，46.61%，35.45%，20.76%，不僅與同期對照（35.45×106cfu/g）相比均具有極顯著差異，而且各處理之間也具有極顯著差異（P<0.01），其中2%菌劑處理對桔梗連作障礙土壤細菌數(shù)量的調整最為顯著。至42 d和56 d時，各處理土壤的細菌數(shù)量雖然有所減少，但減少較緩慢，且各處理細菌數(shù)量仍極顯著高于對照。42 d以后細菌數(shù)量減少的現(xiàn)象說明外加菌劑施入土壤中也有一個周期性的變化，并且要受到土著微生物和病原菌的抵抗，這啟示人們在實際生產中，為了加強生態(tài)調節(jié)劑的效果，應適時進行補施。

圖2 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗根際土壤細菌數(shù)量的影響

2.3 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗根際土壤放線菌數(shù)量的影響

枯草芽孢桿菌PS-8菌劑的施入對土壤放線菌數(shù)量的影響與對細菌數(shù)量影響基本相似。由圖3可知，施加菌劑前測得土壤防線菌數(shù)量為21.51×104cfu/g，隨著時間的延長，對照土壤中的放線菌數(shù)量一直呈現(xiàn)下降趨勢，這正是桔梗連作土壤中微生態(tài)失調，引起放線菌數(shù)量減少的表現(xiàn)。施入枯草芽孢桿菌菌劑后各處理土壤的放線菌數(shù)量均呈現(xiàn)為先下降再上升，后又有所下降的趨勢，至28 d時各處理土壤的放線菌數(shù)量達到最大，CK和1%，2%，3%，4%各菌劑處理土壤的放線菌數(shù)量分別為16.18×104和30.48×104，38.24×104，29.81×104，25.57×104cfu/g，相對于施入菌劑前的土壤放線菌數(shù)量，各處理土壤的放線菌數(shù)量增加率分別為88.38%，136.34%，84.24%，58.03%。其中2%菌劑處理土壤的放線菌數(shù)量最大，而且各處理與對照之間均具有顯著差異（P<0.05），各處理除1%和3%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理之間無顯著差異外，其余均具有顯著性差異。至42 d和56 d時，各處理土壤的放線菌數(shù)量雖然有所減少，但減少較緩慢，且各處理土壤的放線菌數(shù)量仍極顯著高于對照。放線菌是產生農用抗菌素的生防微生物，土壤中放線菌的增多有利于連作障礙土壤的修復。

圖3 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗根際土壤放線菌數(shù)量的影響

2.4 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗根際土壤總真菌數(shù)量的影響

接種枯草芽孢桿菌菌后連作桔梗土壤中總真菌數(shù)量總體表現(xiàn)為明顯下降的趨勢。具體由圖4可知，施入菌劑前測得桔梗土壤中總真菌數(shù)量為45.35×103cfu/g，施入枯草芽孢桿菌PS-8菌劑后，0～42 d對照的總真菌數(shù)量隨著時間的延長一直在上升，42～56 d趨于穩(wěn)定，而各處理總真菌數(shù)量均呈現(xiàn)出開始升高趨勢，這可能是枯草芽孢桿菌PS-8菌劑施入后土壤微生態(tài)發(fā)生調整和適應的過程，而隨后各處理總真菌數(shù)則明顯下降，最終基本維持穩(wěn)定的趨勢。至28 d時，各處理土壤中的總真菌數(shù)降至最低，1%，2%，3%，4%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑各處理的真菌數(shù)量分別為41.73×103，24.29×103，33.28×103，37.38×103cfu/g，與接入菌劑前的土壤相比，分別下降了7.98%，46.44%，26.62%，17.57%，各處理與對照之間及各處理之間均具有顯著差異（P<0.05），其中2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理下降效果最為明顯。至42 d和56 d時，各處理繼續(xù)保持與對照之間具有顯著性的差異。

圖4 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗根際土壤真菌數(shù)量的影響

根據(jù)細菌數(shù)量隨時間增加和總真菌數(shù)量隨時間減少可進一步分析發(fā)現(xiàn)，桔梗連作土壤中接入枯草芽孢桿菌PS-8菌劑后，土壤中細菌和總真菌數(shù)量比值呈現(xiàn)明顯上升的變化趨勢，說明桔梗連作土壤微生物區(qū)系發(fā)生著由“以真菌為主”向“以細菌為主”的轉化。

2.5 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗種植土壤酶活性的影響

植物在受到逆境脅迫情況下，組織細胞內會產生過氧化氫和其它一些過氧化物，這些氧化物會對植物產生損傷作用，影響植物生長。植物一般通過過氧化氫酶（S-CAT）和過氧化物酶來分解過氧化氫和其它過氧化物。S-CAT能催化過氧化氫分解為水和氧氣，從而消除其對植物的損傷。作為對逆境脅迫的響應，植物在受到脅迫時體內S-CAT活性就會上升。從圖5可知，在14，28，42，56 d 時，對照桔梗連作土壤中 S-CAT活性分別為 5.66，5.82，6.03，6.21 mL/g，表現(xiàn)出隨著時間延長一直呈上升的趨勢。而不同比例的枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理的土壤中過氧化氫酶（S-CAT）活性相對于接菌前土壤均明顯降低，且顯著低于同期對照（P<0.05），在28 d時，對照桔梗土壤中S-CAT活性為5.82 mL/g,各處理桔梗土壤中 S-CAT 活性分別為 5.36，4.26，5.05，5.18 mL/g,其中2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理下降最多，與最初土壤S-CAT活性相比下降了21.55%，并顯著低于CK。這說明枯草芽孢桿菌菌劑的施入使連作障礙土壤得到了修復，植物受到的脅迫得到了緩解，植物不需要產生大量的S-CAT作響應。

圖5 枯草芽孢桿菌PS-8對土壤S-CAT活性的影響

從圖6可以看出，施入枯草芽孢桿菌PS-8菌劑后土壤中脲酶（S-UE）活性變化與S-CAT相反，添加1%，2%，3%和4%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑的土壤中S-UE活性與對照相比顯著增高（P<0.05），施入56 d時各處理S-UE酶活性分別為 9.14，10.48，9.83，9.36 mg/g，其中 2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理的脲酶活性最大，高出同期CK 41.05%。土壤脲酶活性與土壤的微生物數(shù)量、有機物質含量、全氮和速效磷含量呈正相關，是土壤氮素狀況和營養(yǎng)的表征指標，連作障礙土壤中施入枯草芽孢桿菌菌劑后脲酶活性增高，說明微生物代謝活動旺盛，可使土壤的氮素營養(yǎng)狀況得到明顯改善。

圖6 枯草芽孢桿菌PS-8對土壤脲酶活性的影響

從圖7可以看出，添加1%，2%，3%和4%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑的土壤中蔗糖酶活性顯著高于同期對照（P＜0.05），施入56 d時各處理土壤蔗糖酶活性分別為 15.37，17.84，15.83，13.87 mg/g，其中2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理效果最為明顯，高出CK 34.64%。蔗糖酶又叫轉化酶，它在土壤中能促進纖維素等糖類的分解，對增加土壤中易溶性營養(yǎng)物質起著重要作用。添加枯草芽孢桿菌的土壤中蔗糖酶活性增高，說明根際促生微生物代謝活性上升，使土壤的營養(yǎng)狀況得到明顯改善。

圖7 枯草芽孢桿菌PS-8對土壤蔗糖酶活性的影響

從圖8可知，添加1%，2%，3%和4%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑的土壤中磷酸酶活性顯著高于同期對照（P<0.05），施入56 d時各處理土壤磷酸酶活性分別為 2.17，2.34，2.23，1.97 mg/g，其中2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理效果最為明顯，較CK高出了29.28%。土壤磷酸酶是一類催化土壤有機磷化合物礦化成無機磷的酶，土壤磷酸酶活性高低直接影響著土壤中有機磷的分解轉化及其生物有效性，這是因為通常土壤對外源無機磷素的利用率極低，施入土壤的無機磷肥大部分被土壤固定、吸附，但植物吸收不多。添加枯草芽孢桿菌的土壤中磷酸酶活性增高提高了植物對磷的利用，因而能提高土壤的肥力，減緩連作障礙，促進桔梗生長。

圖8 枯草芽孢桿菌PS-8對土壤磷酸酶活性的影響

2.6 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗葉片MDA含量的影響

從圖9可知，1%，2%，3%和4%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑分別處理桔梗葉片14 d時，各處理桔梗葉片MDA含量與對照之間無明顯的差異。至28 d時，各處理桔梗葉片MDA含量下降，到達42 d時降至最低，1%，2%，3%和4%枯草芽孢桿菌PS-8各菌劑處理桔梗葉片MDA含量分別為 2.26，1.36，1.57，1.75 μmol/g，顯著低于同期CK（P<0.05）,桔梗葉片MDA含量最低者為2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理。至56 d時，各處理桔梗葉片MDA含量雖然有所上升，但也顯著低于CK（P<0.05），其中2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理最小，2%，3%和4%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑不同處理間桔梗葉片MDA含量沒有顯著差異。MDA是植物受到逆境脅迫后葉片細胞受損程度的反映，整個過程對照葉片MDA含量一直高于各處理，進一步證明了施入枯草芽孢桿菌菌劑后有效地減輕了連作障礙對桔梗生長帶來的脅迫。

圖9 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗葉片中MDA含量的影響

2.7 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗生長的影響

株高是反映植物生長的農藝指標，從圖10可以看出，添加枯草芽孢桿菌PS-8菌劑對桔梗植株生長有明顯的促進作用。在0～14 d內，各處理桔梗株高之間無顯著差異，隨著時間的延長，處理和對照之間株高差距在逐漸加大。至28 d時，與CK相比，1%，2%，3%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑各處理的桔梗株高分別高出對照29%，44.87%，15.28%，40.24%，26.79%，達到顯著差異水平（P<0.05），2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理對桔梗生長的促生作用最好，但4%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理對桔梗生長表現(xiàn)出有抑制作用，此后至42 d和56 d各處理基本上一直保持這種生長趨勢。

圖10 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗幼苗株高的影響

生物量是衡量植物在一定時間內物質累積量的指標，與植物的生長和光合作用密切相關。由圖11可以看出，施入不同量的枯草芽孢桿菌PS-8菌劑對桔梗的地下和地上鮮重均有明顯影響。與對照相比，施入2%枯草芽孢桿菌菌劑56 d后，桔梗植株地下部分增加了51.60%，地上部分增加了43.52%，均達到了顯著水平（P<0.05），可見枯草芽孢桿菌PS-8菌劑能夠減緩連作障礙，對桔梗生長有明顯的促進作用。

圖11 枯草芽孢桿菌PS-8對桔梗幼苗生物量的影響

3 討論與結論

桔梗連作障礙是桔梗種植中面臨的一大難題，導致連作障礙的根本原因在于連作土壤中微生態(tài)結構的失調，表現(xiàn)為細菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增加。同時微生態(tài)的失調又會進一步使土壤酶發(fā)生改變，這是因為土壤酶主要是土壤微生物產生的，土壤微生物結構與土壤中各種酶的含量與活力之間存在一定的相關性[21-23]。細菌和放線菌是土壤中無機物和有機腐植質的分解者，有利于土壤肥力的形成，而真菌增加更易使土壤中的植物病原菌繁殖，因此微生態(tài)的失調最終造成土壤營養(yǎng)和肥力下降，導致作物生長減慢和病蟲害嚴重的連作障礙。

本研究通過向桔梗連作障礙土壤中添加枯草芽孢桿菌PS-8菌劑，發(fā)現(xiàn)施入不同量（1%，2%，3%和4%添加量）的枯草芽孢桿菌PS-8菌劑后，降低了土壤中植物病原菌——尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的數(shù)量，尤以2%枯草芽孢桿菌菌劑處理的效果最為顯著。施入2%枯草芽孢桿菌菌劑到達28 d時，土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量為4.28×105cfu/g，極顯著低于同期對照21.46×105cfu/g（P<0.01）；接種枯草芽孢桿菌 PS-8 菌劑后，連作桔梗土壤中細菌和放線菌數(shù)量顯著上升，而總真菌數(shù)量顯著下降，桔梗連作土壤微生物群落結構發(fā)生了由以“真菌型為主”向“細菌型為主”的變化。細菌增多有利于土壤肥力提高，真菌的增加則容易使病原菌繁殖，因此，枯草芽孢桿菌PS-8菌劑提高了土壤中有益微生物的數(shù)量，桔梗連作土壤根際微生態(tài)環(huán)境發(fā)生了改善。

土壤酶在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起著重要作用，其活性可作為衡量土壤微生物活性和土壤肥力的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)，添加枯草芽孢桿菌PS-8菌劑后，土壤酶的活性也向著有利于土壤肥力增加和連作障礙減輕的方向轉變，表現(xiàn)為施入不同量的枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理后14，28，42，56 d，土壤中S-CAT活性顯著低于同期對照，表明植物受到的土壤環(huán)境脅迫有所緩解。S-UE、蔗糖酶、磷酸酶活性顯著高于同期對照，說明微生物代謝活性上升，土壤的營養(yǎng)狀況得到改善。

MDA的產生是植物對逆境脅迫反應的產物，這是植物對脅迫作出的響應，反映了葉片受損傷的程度。本研究施入不同量的枯草芽孢桿菌PS-8菌劑后，桔梗葉片MDA含量均明顯低于同期對照，其中2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理桔梗葉片中MDA含量最低，與對照相比有顯著差異（P<0.05）。MDA含量低說明連作土壤中施入菌劑后有效改善了土壤中的微生態(tài)環(huán)境，緩解了對桔梗生長的脅迫。

生物量是評價植株生長和健康狀況最直觀的指標之一。本研究進一步測定的農藝性狀表明，枯草芽孢桿菌PS-8菌劑施入桔梗連作土壤后明顯促進桔梗幼苗生長，2%枯草芽孢桿菌PS-8菌劑處理的桔梗幼苗株高和地下地上部分的鮮重都顯著大于對照（P<0.05）?？梢娍莶菅挎邨U菌PS-8一定程度上克服了連作障礙，對桔梗具有促生作用。

促生菌劑對連作障礙土壤的修復作用主要是通過改變土壤的微生物區(qū)系和土壤酶活性而實現(xiàn)的。徐彬等[11]向番茄連作障礙土壤中添加不同比例的枯草芽孢桿菌菌劑，發(fā)現(xiàn)番茄土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量明顯下降，土壤微生物區(qū)系發(fā)生了由“以真菌為主型”向“以細菌為主型”的轉化，土壤酶的活性也向有利于土壤肥力增加和連作障礙減輕的方向轉變，促進了番茄生長。向黃瓜、西瓜和獼猴桃連作障礙土壤中施入不同劑量的枯草芽孢桿菌可緩解脅迫條件下幼苗受到的傷害，提高果實的品質[14-16]。向連作土壤中施入枯草芽孢桿菌可顯著提高土壤中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性，明顯地促進平邑甜茶幼苗的生長[12]。陳立華等[13]研究發(fā)現(xiàn)施用枯草芽孢桿菌生物有機肥的蘆蒿莖稈和扦插苗根際土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量分別降低了93.7%和35.7%，生防效果達到97.1%?？莶菅挎邨U菌對玉米、小麥和大豆等的促生作用，也主要是通過提高其組織中過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高作物對土傳病原菌的抵抗能力，使其免受侵害[17-19]。本研究結果與以上這些研究結果基本一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，向連作土壤中添加枯草芽孢桿菌PS-菌劑后，不僅不同添加量的各處理土壤微生物和酶等與同期對照有顯著的差異，而且各處理之間也有一定的差異，有時也達到了顯著的水平，同時對于施入枯草芽孢桿菌PS-8菌劑的濃度比例也不是越大就越有利于連作障礙土壤的修復改良，這與徐彬等[11]的研究結果基本一致。本研究設計了4種濃度，不論是土壤微生物群落結構、土壤酶活性、桔梗葉片中MDA含量，還是桔梗生長量，在研究中均發(fā)現(xiàn)2%枯草芽孢桿菌PS-8對土壤的修復作用效果最為顯著。這是因為土壤是一個有機的系統(tǒng)，其中各種細菌、放線菌、真菌、病原微生物之間及與植物之間存在著復雜的相促和相抑關系，土壤的營養(yǎng)和“健康”要建立在各種微生物群落之間的平衡上，外加調節(jié)菌劑過大或不足都不利于土壤微生物平衡的建立和土壤的營養(yǎng)與“健康”。另外對于不同植物和不同土壤，這種平衡也可能并不完全一樣。因此，用微生物接種劑對不同連作年限和不同植物的連作障礙土壤修復時，應探索不同菌劑的使用量才能達到理想效果。

另外，枯草芽孢桿菌PS-8菌劑的施入可增加土壤中細菌和放線菌的數(shù)量，降低病原菌及其總真菌的數(shù)量，增加土壤酶活。但本研究發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長其影響效果有呈現(xiàn)下降趨勢，可見外來菌株引入土壤中適應環(huán)境并大量定殖繁殖要受到土著菌株競爭的壓力及土壤環(huán)境的影響。這一現(xiàn)象提示人們在實際生產中應用微生態(tài)菌劑克服連作障礙時，需要在適宜時期進行補施才能達到理想的改善土壤及防病效果。

相對于用化學方法，利用微生物對連作障礙土壤的修復和提高土壤營養(yǎng)具有綠色環(huán)保的特點和優(yōu)勢[24-27]?？莶菅挎邨U菌之所以能對連作障礙土壤起到修復作用，與枯草芽孢桿菌對病原菌較強的競爭、重寄生和抗生作用有關，它能有效抑制土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量增長，改變桔梗根際土壤微生物的生存環(huán)境，實現(xiàn)對連作土壤的生態(tài)修復。本研究通過枯草芽孢桿菌PS-8菌劑對連作障礙土壤微生態(tài)的調整和對桔梗促生作用的研究，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌PS-8具有研發(fā)制成克服桔梗連作障礙生物改良劑的潛力，值得進一步開發(fā)應用。