吳珍

（商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院/商洛市秦嶺植物良種繁育中心，陜西商洛 726000）

桔梗[Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.]為桔?？贫嗄晟乃幱?、食用、觀賞多用植物[1]，桔梗中含皂苷、黃酮、桔梗多糖等多種化學成分，具有抗腫瘤、抗氧化等效用[2]，其花中富含花青素多呈藍、紫等色，花青素具有降低血清及肝臟中脂肪含量、抗腫瘤及抗氧化等作用[3]?；ㄇ嗨厥侵参锏拇紊x產(chǎn)物，植物花色的強弱取決于花青素的合成和積累量[4]，花青素合成以苯丙氨酸為起點經(jīng)三個階段，最終生成穩(wěn)定的花青苷[5]。其中第一階段（苯丙烷途徑）的關(guān)鍵酶有PAL（苯丙氨酸轉(zhuǎn)移酶）、C4H（肉桂酸-4-羥化酶）等，花青素合成的直接前體是第一階段的產(chǎn)物；第二階段是由CHS（查爾酮合成酶）、F3H（黃烷酮 3-羥化酶）等酶催化的類黃酮的合成；第三階段即由DFR（二氫黃酮醇還原酶）、ANS（花青素合成酶）等關(guān)鍵酶催化的花青素的合成及修飾途徑[6]，此階段形成穩(wěn)定的花青素，因而花顏色的形成與PAL、CHS、F3H、DFR、ANS 等一系列關(guān)鍵酶有關(guān)，DFR、ANS基因的表達量與花青素積累及花色強度密切相關(guān)。植物生長物質(zhì)、光、溫度、水分脅迫、糖、氮和磷及金屬離子等植物生長中的生物和非生物因子都調(diào)控花青素的合成，光也是諸多影響花青素等次生代謝產(chǎn)物的種類和含量的重要環(huán)境因子之一[7-8]，光質(zhì)、光強度及光照時間均能影響花青素的合成，而光質(zhì)起著關(guān)鍵作用[9]，光質(zhì)能誘導酶活性改變，從而調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的分配，進而影響植物活性成分的含量[10]。在綠色組織及組織培養(yǎng)的細胞中，光主要通過激活花青素代謝途徑中相關(guān)基因的表達來合成并積累花青素，對合成花青素最有效的藍光和紫外光可以增強相關(guān)基因的表達，提高酶活性，促進植物呈色[11]。目前關(guān)于花青素合成積累調(diào)控的研究多集中于果蔬和觀賞植物類，關(guān)于藥用植物花青素合成積累與環(huán)境因子的相關(guān)性方面的研究少見報道。本文探討不同光學濾膜處理的桔梗葉中花青素相對含量與DFR、ANS活性變化的相關(guān)性，為進一步研究桔梗有效成分的積累和花色的形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用商洛學院秦嶺植物良種繁育中心的一年生桔梗苗，定植于直徑30 cm、高度40 cm的花盆中，用田園土與肥料混勻成盆土。每盆種3株。桔梗植株長至12～16片葉時，將5面用濾膜覆蓋的鋼架置于花盆上方進行處理，支高盆底以通風，其它管理正常。處理后每7 d采樣1次，共采樣3次，測定葉中花青素含量和DFR、ANS活性，所有處理均重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 花青素含量測定

取0.3 g新鮮葉片置于1 mL 1%HCl-甲醇（1%HCl，m/v）中，在室溫下震蕩（50 r/min）18 h后，取樣品于14 000 r/min離心，沉淀1 min后，取0.4 mL上清液加到0.6 mL的1%HCl-甲醇溶液中，于530 nm和657 nm下測定提取液的吸光值，以1%HCl-甲醇溶液為空白對照，以ΔA=(A530nm－0.25×A657nm)/g 表示花青素含量[12]。

1.2.2 DFR活性測定

酶液提取：葉片剪碎稱取0.2 g加預(yù)冷的提取液［0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5），0.01 mol/L抗壞血酸，5mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），0.1% β-巰基乙醇，0.01 mol/L對氨基苯基甲磺酰（APMSF）］6 mL，冰浴研磨，12 000 r/min低溫離心20 min，沉淀用提取液重復(fù)提取，上清液為DER粗酶液[13]，低溫保存。

酶活性測定：配1.1 mL反應(yīng)混合液（0.1 mol/L Tris buffer pH 7.4，1 μmol/L 二氫槲皮素（DHQ），1 μmol/L NADPH，0.3 mL粗酶液），30 ℃水浴1 h后加1 mL乙酸乙酯，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)（40℃），重復(fù)3次，合并提取液用0.2 mL蒸餾水提取3次后加1 mL丁醇-鹽酸（95:5，V/V）于提取物中，95℃熱水浴 30 min使酶失活，測550 nm吸光度，以每分鐘吸光值變化0.01所需的酶量為1個酶活性單位，即1 U，計算DFR 活 力[14]：DFR 活 力 =(ΔA550nm×1.8 ×2)/(0.01×0.6×mFW)。

1.2.3 ANS活性測定

酶液提取及測定參照杜麗娟[15]的方法，稱取桔梗葉片1.0 g放入研缽中，加5 mL預(yù)冷的提取液[0.1 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），40 mmol/L蔗糖，0.75 mmol/L聚乙二醇 20 000，0.1 mol/L抗壞血酸鈉，1.0 mmol/L DTT，25 umol/L 氯化鈣，pH 7.3]，冰浴研磨，濾液于10 000 r/min低溫離心30 min，上清液即粗酶液，低溫保存。

酶活性測定：取粗酶液350 μL于試管中，依次加入 40 mmol/L PBS（pH 7.0）1.5 mL，1.0 mol/L氯 化 鈉 600 μL，0.1mol/L 麥 芽 糖 300 μL，0.1mol/L DTT 150 μL，80 mmol/L 抗壞血酸鈉150 μL，40 mmol/L α-酮戊二酸 75μL，16 mmol/L FeSO475 μL， 加入 1.0 mmol/L DHQ 50 μL 開始反應(yīng)，30℃下水浴2 min。340 nm監(jiān)測2 min內(nèi)的二輕槲皮素轉(zhuǎn)換為槲皮素的吸光度變化來測定ANS活性。在30℃，以每毫克蛋白1 min DHQ催化底物生成產(chǎn)物槲皮素的吸光度變化為1個ANS單位。每處理花青素含量及活性測定均重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用Graphpad prism 5及SPSS17.0進行顯著性和相關(guān)性分析，并建立不同處理桔梗葉中花青素含量與DFR、ANS活性的回歸模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 光質(zhì)對桔梗葉中花青素含量的影響

由圖1可看出，與日光下的對照組（CK）相比，在處理7，14，21 d時，藍膜下桔梗葉中花青素含量顯著高于 CK（P<0.05），紫膜下在 7，14 d時花青素含量顯著高于CK（P<0.05），21 d時花青素含量雖高于CK但不顯著；藍色和紫膜處理下花青素含量均呈現(xiàn)先增加后下降的總趨勢（P<0.05）。紅膜處理7 d時花青素含量顯著高于CK（P<0.05），14 d時雖高于CK但不顯著，21 d時顯著低于CK（P<0.05），紅膜處理花青素含量雖呈現(xiàn)先增加后下降趨勢但未達顯著水平。在處理7，14，21 d時黃膜及綠膜下桔梗葉中花青素含量均顯著低于對照（P<0.05），均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢但未達顯著水平。在3次測定中桔梗葉中花青素含量高低次序均為藍膜>紫膜>紅膜>CK>黃膜>綠膜。

圖1 不同光質(zhì)對桔梗葉中花青素含量的影響

2.2 光質(zhì)對桔梗葉中DFR活性的影響

由圖2可以看出，與CK相比，在處理7，14，21 d時，藍、紫和紅膜處理下桔梗葉中DFR活性均顯著增強CK（P<0.05），黃、綠膜處理下DFR活性雖均高于CK但只在14 d時達顯著水平（P<0.05）。7 d時DFR活性由高到低依次為藍膜>紫膜>紅膜>黃膜>綠膜>CK；14 d和21 d時DFR活性由高到低依次為藍膜>紫膜>紅膜>綠膜>黃膜>CK；各組桔梗葉中DFR活性均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢但均未達顯著水平。

圖2 不同光質(zhì)對桔梗葉中DFR活性的影響

2.3 光質(zhì)對桔梗葉中ANS活性的影響

由圖3可以看出，在處理7 d時各處理組桔梗葉片中ANS活性均顯著高于CK（P<0.05），ANS活性依次為藍膜>紫膜>黃膜>綠膜>紅膜>CK；14 d時藍、紫膜處理下ANS活性仍顯著高于CK（P<0.05），黃、綠、紅膜處理組 ANS活性雖均高于CK但也都不顯著，各處理下ANS活性依次為藍膜>紫膜>紅膜>黃膜>綠膜>CK；在處理21 d時，各處理桔梗葉中ANS活性均比14 d急劇下降且低于各處理在7 d的ANS活性，黃膜、綠膜處理下ANS活性均低于CK，但均不顯著；藍、紫、紅膜處理下的ANS活性仍高于CK，且紫、紅膜處理組達顯著水平（P<0.05）；各處理下 ANS活性依次為紫膜>紅膜>藍膜>CK>綠膜>黃膜。3次測定中，藍、紫膜處理桔梗葉中ANS活性均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而綠膜組ANS活性在7 d達到高峰后就開始持續(xù)顯著下降（P<0.05），黃膜、紅膜處理組也呈現(xiàn)相同下降趨勢但未達顯著水平。

圖3 不同光質(zhì)對桔梗葉中ANS活性的影響

2.4 花青素含量與DFR、ANS活性的相關(guān)性分析

由表1可知，各處理桔梗葉中花青素含量與DFR活性均顯著相關(guān)（P<0.05），除第7 d綠膜處理組外其余各處理都達到極顯著水平（P<0.01）；除第7，14 d黃膜處理和第21 d綠膜處理外，其余各處理桔梗葉中花青素含量與ANS活性均呈現(xiàn)顯著相關(guān)（P<0.05）。采用線性回歸法建立的回歸模型（表2）可進一步驗證藍、紫、紅膜處理及CK桔梗葉中花青素含量與DFR、ANS活性均呈顯著線性關(guān)系（P<0.05），可初步認定DFR、ANS均為影響桔?；ㄇ嗨睾铣傻年P(guān)鍵酶。由表3中多元回歸分析結(jié)果可得出桔梗 葉中花青素含量關(guān)于DFR、ANS活性的總回歸方程y=0.242x1+0.261x2-9.148，方差分析結(jié)果F為 368.695（P<0.000 1），該回歸方程多元決定系數(shù)R2為0.935、直接通徑系數(shù)即表 3 中標準系數(shù) 0.396，0.598（P<0.001），表明DFR、ANS活性與花青素含量都呈顯著的線性關(guān)系，誤差對因變量的剩余通徑系數(shù)，說明尚有剩余影響因素未被考慮，有待進一步研究。

表1 桔梗葉中花青素含量與DFR、ANS活性的相關(guān)性

表2 桔梗葉中DFR、ANS活性對花青素含量影響的線性回歸模型

表3 桔梗葉中DFR和ANS活性對花青素含量影響的多元回歸分析

3 討論與結(jié)論

植物的葉片在光信號轉(zhuǎn)導及光控發(fā)育過程中起著重要作用，葉中含有光敏素等光受體，是感受光周期的主要器官，可將信號傳遞到花組織中，激活花青素的合成通路，從而使花器官呈色，同時葉作為主要光合器官提供了合成原料和酶、轉(zhuǎn)錄因子等，因而直接影響花器官的生長發(fā)育及花青素的合成速度和含量。

本研究發(fā)現(xiàn)，藍、紫色濾膜處理下的光能顯著提高桔梗葉中的花青素含量和DFR、ANS活性，花青素含量與DFR、ANS活性的動態(tài)變化規(guī)律呈現(xiàn)一致性，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明藍、紫兩種色光能提高花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶的活性，從而促進了花青素合成與積累，花青素含量與DFR、ANS活性的線性回歸模型[16]也驗證了這一結(jié)論，說明DFR、ANS均為花青素合成途徑的關(guān)鍵酶。本研究通過分析結(jié)果則說明不僅DFR、ANS能引起花青素含量的變化，而且代謝通路中的各種酶都有可能引起花青素含量的變化，植物花青素也具有多條合成途徑并受多種酶的調(diào)控，同種酶在不同植物的花色苷合成途徑中的作用不盡相同[17-18]；ANS活性的直接通徑系數(shù)（0.598）大于DFR活性的直接通徑系數(shù)（0.396），說明ANS活性對花青素含量的直接影響大于DFR的影響，這有可能是因為在花青素合成第三階段中ANS（花青素合成酶）位于DFR（二氫黃酮醇還原酶）等關(guān)鍵酶的下游，其距離最終產(chǎn)物的合成更近，通過對花青素的合成及修飾途徑影響花青素含量；剩余通徑系數(shù)為0.254，說明有多種酶[19]（各個路徑的各種關(guān)鍵酶）與DFR、ANS共同調(diào)控花青素的合成，有關(guān)光質(zhì)對桔梗葉和花中花青素合成途徑中其他幾種關(guān)鍵酶活性的影響也需進一步進行研究。

本研究中藍、紫膜處理21 d時花青素含量雖仍顯著高于對照，但是已呈現(xiàn)下降趨勢，可能是由于試驗中所用光學濾膜的顏色、厚度及透光率造成光通過濾膜后的光強度有所下降，所以處理時間較長后因光強度不足影響植株的光合等初生代謝因而影響次生代謝導致試驗產(chǎn)生誤差，因而還需進一步研究。

此外本研究只探討了光質(zhì)對桔?；ㄇ嗨睾铣纱x途徑的影響，而光強度及光照時間對桔梗花青素合成及酶活性的研究也有待于繼續(xù)進行，需進一步利用多種環(huán)境因子進行科學試驗才能更合理地解釋光對桔梗綠色組織花青素合成及花色的形成的影響，為桔梗的良種選育、栽培及藥、食、賞等品質(zhì)的提高建立基礎(chǔ)。